1、動物組織中DNA的提取與鑒定,實驗目的,掌握動物組織中DNA提取的原理和操作過程 了解DNA的組分，掌握DNA的定性檢測的具體方法 掌握DNA純度檢測和濃度測定方法,實驗原理DNA提取,動物組織細胞中的核糖核酸(RNA)與脫氧核糖核酸(DNA)大部分與蛋白質結合形成核蛋白。RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同濃度氯化鈉溶液中的溶解度有顯著區(qū)別。DNA核蛋白在0.14 mol/L 氯化鈉中溶解度低，但在1 2 mol/L氯化鈉中溶解度高；RNA核蛋白在0.14 mol/L氯化鈉中溶解度仍有相當大的溶解度。調節(jié)氯化鈉濃度，可使RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取開來。,氯仿-異戊醇溶液可以使核蛋白變性沉

2、淀，將核酸物質萃取出來；再向萃取液中加入適量乙醇，可使DNA析出。氯仿異戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA純化研究中非常常用，氯仿-異戊醇抽提的原理是，氯仿可使蛋白質變性并加速有機相與液相分層；異戊醇有助于消除抽提過程中產生的氣泡。而DNA不溶于乙醇等有機溶劑，因此可以通過乙醇沉淀來純化和濃縮DNA。,實驗原理DNA提取,實驗原理DNA鑒定,DNA是由脫氧核糖核苷酸單體構成，其組成部分包括磷酸、有機堿（嘌呤與嘧啶）、戊糖（脫氧核糖）。 1）磷酸 磷鉬酸 鉬藍 （顯藍色） 2）嘌呤堿 嘌呤銀化合物（灰褐色、絮狀） 3）脫氧核糖 -羥基-酮基戊醛 藍色化合物,Vc 或 氨基萘酚磺酸,鉬酸銨,硝酸銀,硫

3、酸,二苯胺,含有0.14 mol/L NaCl的0.015 mol/L檸檬酸鈉溶液 1mol/L NaCl溶液 氯仿-異戊醇（24 : 1, V/V） 95%乙醇 氨水溶液 5% AgNO3溶液,實驗試劑,7.2.5%鉬酸銨試劑 （取蒸餾水400 mL，加入濃硫酸83 mL，將鉬酸銨25 g溶于其中，最后稀釋至1 L，冰箱放置一個月不變質） 8. Vc-鉬酸銨溶液 （稱取還原型抗壞血酸0.53 g溶解于100 mL 2.5%鉬酸銨溶液，貯于棕色瓶中，當天配制） 3, 5-二羥基甲苯試劑（取比重1.19的HCl 100mL，加入FeCl36H2O 100 mg及二羥甲苯100 mL，混合溶解后，

4、置于棕色瓶中，臨用前新鮮配制） 二苯胺試劑（取1 g純的二苯胺溶于10 mL重蒸餾的冰乙酸中，加入2.75 mL濃硫酸，放置于棕色瓶，臨用前新鮮配制）,實驗儀器,電子天平 勻漿器 電爐,離心機 紫外分光光度計,（一）DNA的提取 取新鮮豬肝組織3 g，加入0.14 mol/L NaCl，0.015 mol/L檸檬酸納溶液6 mL，在乳缽中加入少量石英砂仔細研磨成勻漿，或用組織勻漿器勻漿30 s； 將勻漿倒入離心管，4000 rpm，15 min，棄上清； 沉淀中加入15 mL 1mol/L NaCl，混勻，攪拌數分鐘， 4000 rpm，15 min，棄沉淀； 上清轉移至另一離心管，加入等體積

5、的氯仿-異戊醇（24 : 1, V/V），劇烈振搖10 min， 4000 rpm，10 min； 取上層，轉移至另一離心管，加入等體積95%乙醇，可見白色絲狀沉淀，可用玻棒慢慢纏繞取出沉淀，或4000 rpm，10 min，離心取沉淀（DNA粗品），用1 mL蒸餾水稀釋溶解DNA。,實驗步驟,（二）DNA的鑒定 取部分DNA溶液加入試管，加4 mL5%（m/V）H2SO4，再用帶有長玻璃管的軟木塞塞緊管口，在沸水浴中加入15 min，靜置數分鐘水解DNA，取上清進行鑒定分析； 取DNA水解液1 mL，加二苯胺試劑2 mL，搖勻于沸水浴中加熱10 min，觀察顏色變化； 取0.5 mL5% A

6、gNO3溶液，逐滴加入10% 氨水，并使沉淀剛好溶解為宜，然后逐滴加入DNA水解液觀察并記錄現象； 取0.5 mL DNA水解液，加入Vc-鉬酸銨溶液1 mL，搖勻，放置10 min，有何現象？再將溶液加熱，又發(fā)生什么變化，請解釋之。,實驗步驟,（三）DNA的純度測定與定量 取DNA提取液0.1 mL，用水或緩沖液稀釋一定濃度，用紫外分光光度計分別測定同一樣品的260 nm和280 nm的吸光值（OD），檢測DNA的純度及濃度。 若A260 nm / A280 nm 接近于1.8，則說明DNA樣品的純度高； DNA濃度（g/mL） = A260 nm 50 稀釋倍數 （1/光經） DNA得率（mg）