1、1,動物繁殖學(xué)實驗,山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 動物繁殖學(xué)教研室,2,實習(xí)目的,動物繁殖學(xué)實驗是動物繁殖學(xué)實踐教學(xué)的重要組成部分； 為畢業(yè)后從事動物生產(chǎn)科學(xué)研究和應(yīng)用、生產(chǎn)服務(wù)管理打下基礎(chǔ)。,3,實習(xí)要求,主要學(xué)習(xí)掌握精液品質(zhì)分析、人工授精、發(fā)情鑒定、直腸檢查等繁殖基本技術(shù)； 掌握動物超數(shù)排卵、胚胎采集、胚胎移植等技術(shù)的基本方法。,4,實習(xí)內(nèi)容,1、生殖器官標(biāo)本觀察； 2、人工授精器械、胚胎移植器械的識別和使用； 3、理化因素對精液品質(zhì)的影響； 4、精液冷凍、解凍與精液品質(zhì)評價； 5、直腸檢查； 6、超數(shù)排卵、胚胎采集、胚胎移植； 7、畜牧場畜群繁殖力調(diào)查與評價。,5,實習(xí)過程安排,與理論課在同

2、學(xué)期，集中實習(xí)，分組進(jìn)行。 根據(jù)實踐操作、考勤、實習(xí)報告（實習(xí)時間、內(nèi)容、操作技術(shù)、體會等）等綜合評定成績。,6,實驗一 公、母畜生殖器官觀察,一、目的要求 認(rèn)識各種公母畜生殖器官的位置、形態(tài)、大小及解剖結(jié)構(gòu)特點； 了解生殖器官的結(jié)構(gòu)與生理功能的關(guān)系。 為學(xué)習(xí)家畜繁殖學(xué)及更好地掌握和應(yīng)用繁殖技術(shù)奠定解剖學(xué)基礎(chǔ)。,7,二、材料和方法,（一）材料 1各種公、母畜生殖器官標(biāo)本、模型及掛圖（或投影）。 2大磁方盤、解剖刀、剪刀、鑷子、金屬探針、投影儀。 （二）方法 用投影與標(biāo)本觀察相結(jié)合；比較各種家畜生殖器官的異同。,8,三、內(nèi)容,（一）雄性動物生殖器官 1、觀察各種動物睪丸和附睪的形狀、相對位置和大

3、體構(gòu)造。 2、副性腺：比較各種動物副性腺的大小、形狀、位置及內(nèi)部構(gòu)造。 精囊腺： 前列腺： 尿道球腺： 3、陰莖和龜頭,9,（二）雌性動物生殖器官 雌性動物可以觀察生殖器官的標(biāo)本、模型及掛圖，也可以采用腹腔鏡法進(jìn)行活體觀察。 1、生殖器官的組成及位置 2、卵巢 3、輸卵管 4、子宮 5、陰道 6、外生殖器官,10,四、作業(yè),1通過觀察和比較，說明各種公、母畜生殖器官的形態(tài)、大小、相互關(guān)系和大體構(gòu)造以及在活體上的位置有何特點。 2繪出任一種公、母畜生殖器官的標(biāo)本圖。,11,實驗二 睪丸、卵巢組織學(xué) 及精子發(fā)生、卵泡發(fā)育過程的觀察,一、目的和要求 通過家畜睪丸、卵巢組織切片觀察，了解家畜睪丸、卵巢

4、的組織結(jié)構(gòu)及其形態(tài)。 了解精子的發(fā)生和卵子的發(fā)生、卵泡的發(fā)育過程及其形態(tài)。,12,二、材料和方法,（一）材料、儀器 1、睪丸、卵巢組織切片；睪丸、卵巢組織學(xué)及精子發(fā)生、卵泡發(fā)育過程的幻燈片、多媒體投影儀或膠片投影儀。 2顯微鏡、幻燈機(jī)或投影儀。 （二）方法 先結(jié)合投影或掛圖進(jìn)行講解，對睪丸、卵巢組織學(xué)結(jié)構(gòu)及精子發(fā)生、卵泡發(fā)育過程有了初步的了解。然后再用顯微鏡進(jìn)行睪丸、卵巢組織切片的觀察。,13,三、內(nèi)容、觀察步驟,（一）公畜睪丸的組織學(xué)觀察 1低倍鏡觀察 （1）被膜 （2）睪丸縱隔和中隔 （3）睪丸小葉：,14,2高倍鏡觀察： （1）睪丸小葉的結(jié)構(gòu) （2）間質(zhì)細(xì)胞 （3）曲精細(xì)管的結(jié)構(gòu) （4）

5、足細(xì)胞 （5）生精細(xì)胞（生殖細(xì)胞）,15,3精子發(fā)生過程（spermatogenesis）可分為兩個明顯的時期。 第一時期：精細(xì)胞生成：精原細(xì)胞經(jīng)一系列分裂形成精子細(xì)胞。 第二時期：精子形成（spermiogenesis）：精子細(xì)胞變形成為精子。,16,（二）母畜卵巢的組織學(xué)觀察,1低倍鏡觀察 在低倍鏡下找出卵巢表面上皮和白膜，區(qū)分卵巢的皮質(zhì)部和髓質(zhì)部。 （1）表面上皮 （2）白膜 （3）皮質(zhì)部 （4）髓質(zhì)部,17,2高倍鏡觀察 （1）卵泡發(fā)育的觀察 每個卵泡都由位于中央的卵母細(xì)胞和圍繞在卵母細(xì)胞周圍的卵泡細(xì)胞所組成。有的卵泡在發(fā)育過程中可能退化而形成閉鎖卵泡。卵泡可根據(jù)發(fā)育程度不同而分成下列

6、各期。 1）原始卵泡 2）初級卵泡 3）次級卵泡 4）三級卵泡 5）成熟卵泡 6）閉鎖卵泡,18,（2）黃體 是排卵后的卵泡轉(zhuǎn)變成的富于血管的內(nèi)分泌器官。 牛、羊、豬的黃體位于卵巢皮質(zhì)淺層突出于表面。 馬的黃體則完全埋藏在卵巢深部。 根據(jù)黃體發(fā)育階段而分成下列各期。 1）血體期 2）血管增生期 3）成熟期 4）白體期,19,3輸卵管組織學(xué),輸卵管從外向內(nèi)由漿膜、肌層和粘膜三層不同細(xì)胞層構(gòu)成。 （1）粘膜 上皮 固有膜 （2）肌層 （3）漿膜,20,4子宮組織學(xué) 內(nèi)膜 肌層 外膜,21,四、作業(yè)： 1繪出并注明睪丸曲精細(xì)管及其所含細(xì)胞的構(gòu)造圖。 2繪出并注明卵巢組織結(jié)構(gòu)及卵泡發(fā)育各階段示意圖。,

7、22,實驗三 兔的超數(shù)排卵、胚胎移植 及早期胚胎觀察,一、目的和要求 通過實驗了解促卵泡素（FSH），孕馬血清促性腺激素（PMSG），人絨毛膜促性腺激素(hCG)的作用。 了解卵子的正常和異常形態(tài)結(jié)構(gòu)，認(rèn)識受精卵和未受精卵之區(qū)別。 初步掌握沖卵、檢卵技術(shù)，為掌握胚胎移植技術(shù)打下基礎(chǔ)。,23,二、材料和儀器設(shè)備,1動物： 選擇健康的成年未孕母兔。 分組后，用作超排處理的供體。 另外，準(zhǔn)備兩只母兔，作胚胎移植受體。 實驗?zāi)竿米詈糜卯a(chǎn)過仔的母兔，效果較好。 需公兔23只。 2藥品： FSH、PMSG、hCG、0.9NaCl、75酒精、碘酒、新潔而滅、沖卵液、846麻醉藥。 3器材： 玻璃注射器（20

8、ml、10ml、1ml），兔用手術(shù)臺、創(chuàng)巾、止血紗布、藥棉、縫針、縫線、消炎粉、青霉素、鏈霉素、剪毛剪、止血鉗、鑷子、手術(shù)刀、剪、塑料細(xì)管（沖卵管）、表面皿、移卵管、連續(xù)變倍實體顯微鏡。,24,三、供體兔超排分組及操作步驟,FSH處理組： 先用碘酒棉球消毒母兔頸部皮膚，每只頸部皮下注射FSH1015IU或0.15mg（動物所產(chǎn)品）。連續(xù)注射6次，每次相隔1014h。總量為0.9mg/只。最后一次注射FSH后12h，從耳靜脈注射hCG75IU（先用酒精棉球消毒耳朵邊緣）。 隨即放置于公兔籠中，觀察是否配種。 超排處理后，母兔陰部表現(xiàn)出發(fā)情癥狀，能成功地配種。 PMSG處理組： 母兔頸部皮膚消毒同

9、上。于頸部皮下一次注射PMSG150IU。之后4872h時，同上述方法注射同量hCG。即同公兔交配。 對照組： 頸部皮下注射生理鹽水。其它處理同上。,25,四、手術(shù)沖胚方法,于注射hCG并與公兔交配后24、36或48h，進(jìn)行沖胚。 1應(yīng)用乙醚、烏拉糖、846麻醉藥（耳靜脈注射0.3ml/只）等麻醉后，再按外科手術(shù)要求打開腹腔。 2將母兔背朝下方固定于兔手術(shù)臺上。 3在兔腹部最后兩對乳頭的腹中線部剪毛，用沾滿肥皂液的紗布清洗局部，再用剃須刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由內(nèi)向外進(jìn)行消毒。然后蓋上創(chuàng)巾并固定。 4用手術(shù)刀在腹部正中線處皮膚切開23cm長的術(shù)口，再在腹壁肌白線上切一小口，用中指墊著以手

10、術(shù)剪來擴(kuò)大剪口。 5.沖卵時，注意止血，隨時用溫生理鹽水紗布保溫術(shù)部。,26,6.打開腹腔后，沿著子宮輕輕引出輸卵管及卵巢。與卵巢下脂肪組織處，用長夾夾住以固定卵巢。仔細(xì)觀察卵巢的變化。記錄排卵點（卵巢排過卵后的小紅點）。 7.先在卵巢附近找到輸卵管傘，從傘部插入沖卵管并用手指或夾子固定，另一端接表面皿。另一人用10ml注射器配上9號針頭，吸一管沖卵液（也可用生理鹽水代替）。 8.從子宮向輸卵管方向，于子宮角末端和輸卵管交界的無血管處插入針頭，使針頭伸入輸卵管內(nèi)并用手指固定。然后慢慢的推動注射器，將沖卵液注入輸卵管，使沖卵液由傘部收集到表面皿內(nèi)。一般每次5ml即可。注意沖卵液不得流失。,27,

11、五、胚胎觀察,將接有沖卵液的表面皿置于實體顯微鏡下，檢查胚胎的數(shù)量和發(fā)育形態(tài)。 正常兔受精卵為卵圓形，直徑約140m，在透明帶外圍有一厚層粘蛋白層（為兔胚胎特有結(jié)構(gòu)）。卵黃顆粒很細(xì)，分布很均勻。容易看到核的變化。在卵黃周隙內(nèi)可見兩個極體。 未受精的卵母細(xì)胞中，粗細(xì)不一的卵黃顆粒清楚可見，且分布不均。不能看到細(xì)胞核。在卵黃周隙內(nèi)只有一個極體。 一般在交配后24h，受精卵已發(fā)育成2-細(xì)胞胚胎。48h即發(fā)育成16-細(xì)胞胚胎（早期桑椹胚）。,28,六、胚胎移植,1受體的選擇： 選擇與供體發(fā)情時間一致（相差不超過一天）的受體（自然發(fā)情或超排處理誘發(fā)發(fā)情）。 2麻醉、保定及開腹手術(shù)： 參照供體處理方法。

12、3胚胎分裝： 先向移卵管內(nèi)吸進(jìn)少量PBS，接著吸入一點空氣，然后再將胚胎連同少量PBS吸入，接著再吸入一點空氣和PBS, 在移卵管尖端需保留一端空隙。這樣就可防止胚胎丟失。 4移植部位： 將胚胎移入排卵側(cè)的生長道內(nèi)。凡從供體輸卵管內(nèi)得到的胚胎應(yīng)移植到受體輸卵管內(nèi)。從輸卵管傘部插入23cm深，輕輕地注入胚胎，然后慢慢地抽出移卵管。一般一側(cè)輸卵管可移植510枚胚胎。如從供體子宮內(nèi)收集的胚胎也應(yīng)移植到受體母兔相應(yīng)的部位。 5按外科手術(shù)要求分別縫合肌層和皮膚。并進(jìn)行消毒。注意術(shù)后護(hù)理。,29,七、作業(yè),簡述實驗過程和結(jié)果，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。,30,實驗四 小鼠超數(shù)排卵及早期胚胎的質(zhì)量鑒定,一、目的和要

13、求 通過實驗及操作，使學(xué)生了解孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）對卵巢機(jī)能的生理作用，掌握超數(shù)排卵方法和早期胚胎的質(zhì)量鑒定。 充分認(rèn)識正常與異常胚胎的形態(tài)結(jié)構(gòu)及等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，為大家畜超數(shù)排卵和胚胎移植打下良好的基礎(chǔ)。,31,二、材料,1實驗動物： 56周齡昆明白系雌性小鼠為超數(shù)排卵的供體，成年同系公鼠與之1:1配比。 2藥物與試劑： PMSG、hCG、75酒精、沖胚液（mPBS）、礦物油。 3器材： 一次性1ml注射器、鑷子、剪刀、表面皿、巴氏吸管、直徑35mm培養(yǎng)皿、實體顯微鏡等。,32,三、超數(shù)排卵方法及胚胎采集,取56周齡昆明白系雌性小鼠，間隔48h分別腹腔注射

14、10IU PMSG和hCG，hCG注射后與性成熟公鼠合籠，次日檢查陰道栓。 有栓雌鼠在注射hCG后7884h處死、摘取子宮。 在實體顯微鏡下，用含有mPBS液的1ml注射器將子宮置于表面皿中沖洗3遍，以回收桑椹胚及早期囊胚。 操作液和胚胎置于37恒溫臺上保存。,33,四、胚胎質(zhì)量鑒定,將回收的胚胎用mPBS洗凈后，移入新鮮的覆蓋有礦物油的100l mPBS液滴中，在410倍以上實體顯微鏡下進(jìn)行胚胎質(zhì)量鑒定。 （一）胚胎的級別劃分 目前對胚胎的質(zhì)量鑒定基本上采用形態(tài)學(xué)的方法 將胚胎分為A級（1級）、B級（2級）、C級（3級）和D級（4級）四個級別。 其中A級和B級胚胎為可移植胚胎。,34,（二）

15、異常胚胎 異常胚胎指胚胎體積過小、過大、呈橢圓形、扁形、帶有大型極體，細(xì)胞內(nèi)有大空泡，透明帶破裂、收縮，卵裂球色澤發(fā)暗、界限不清、個別萎縮、邊緣變得粗糙，空透明帶，在透明帶內(nèi)無一定結(jié)構(gòu)的變性胚胎等。,35,（三）未受精卵 呈圓球形，外周有一圈折光性強(qiáng)且發(fā)亮的透明帶，中央為質(zhì)地均勻色澤較暗的細(xì)胞質(zhì)，透明帶和卵黃膜之間的空隙很小甚至看不到。,36,五、作業(yè),將觀察到的不同發(fā)育階段的正常胚胎、異常胚胎或未受精卵繪圖并加以說明。,37,實驗五 人工授精器材的認(rèn)識和假陰道的安裝,一、目的和要求 1熟悉人工授精所用的采精和輸精器材,了解其用途及使用方法。 2練習(xí)假陰道的安裝方法。,38,二、材料和儀器設(shè)備

16、,1采精器材： 各種公畜采精用假陰道，牛、羊電刺激采精棒，豬手握法采精用的橡膠手套等。 2輸精器材： 各種母畜輸精器、陰道開張器、額燈和手電筒。 3輔助器材及藥品： 高壓滅菌器、酒精燈、長柄鉗、鑷子、玻璃棒、棒狀溫度計、漏斗、量杯、滅菌凡士林、70和95酒精棉球、滑石粉、來蘇兒、洗衣粉等。,39,三、方法和步驟,先講解人工授精器材的構(gòu)造、各部名稱和用途，并作假陰道安裝的示范。然后學(xué)生分組觀察并作假陰道的安裝練習(xí)。 （一）人工授精器材的認(rèn)識： 1假陰道： 長筒狀，由外殼、內(nèi)胎和集精杯（管）三個主要部分組成。 外殼 內(nèi)胎 集精杯（管） 2輸精器： 蘇式牛、羊輸精器為一長頸玻璃注射器。 目前常用的為

17、金屬或塑料制成的輸精管，其后連接一個橡皮球。冷凍細(xì)管精液輸精則使用特制的卡蘇槍或輸精器。 對一些家畜的輸精需借助陰道開張器和額燈或手電筒照明進(jìn)行。開張器的種類和大小因畜種而異。,40,（二）假陰道的準(zhǔn)備要點,1假陰道外殼及內(nèi)胎的檢查 2采精器材的清洗 3內(nèi)胎的安裝： 4消毒 5集精杯（管）的的安裝 6注水： 7涂潤滑劑： 8調(diào)節(jié)假陰道內(nèi)腔的壓力： 9假陰道內(nèi)腔溫度的測量： 10用一塊褶成四折的消毒紗布蓋住假陰道入口，以防灰塵落入，即可準(zhǔn)備采精。,41,(三) 輸精器材的準(zhǔn)備,金屬和玻璃制成的輸精管、輸精槍，最好用高壓蒸汽消毒，在輸精前最好將輸精管用稀釋液沖洗12次。 細(xì)管冷凍精液的輸精器一般由

18、金屬外殼和里面的推桿組成。使用前金屬外套應(yīng)進(jìn)行消毒，前端的金屬套不能連續(xù)使用。使用時將細(xì)管的一端剪去，另一端插在輸精槍的推桿上。借助推桿，推動細(xì)管中的活塞即可將精液推出。 若采用開張器法輸精，需對開張器先進(jìn)行嚴(yán)格消毒方可使用。,42,四、作業(yè),指出各種公畜采精器材的異同及優(yōu)缺點，試提出改進(jìn)意見。,43,實驗六 精液品質(zhì)的肉眼檢查及精子活率評定,一、目的和要求 掌握檢查精子密度、評定活率的方法； 熟悉肉眼檢查精液品質(zhì)的方法； 驗證觀察理化因素對精子運(yùn)動及生存能力的影響。,44,二、材料和儀器,1精液： 牛、豬或兔等任一種動物的精液。 2藥品器械： 顯微鏡、顯微鏡保溫箱（或顯微鏡恒溫臺）、載玻片、

19、蓋玻片、搪瓷盤、溫度計、滴管、擦鏡紙、紗布、試管、3%和0.9%氯化鈉溶液、2%煤酚皂溶液、1/1000新潔而滅溶液、76%酒精、5%伊紅、1%苯胺黑。 3精子密度的投影圖表,45,三、內(nèi)容和方法,（一）精液的肉眼觀察 觀察測定下列各項結(jié)果并記入登記表內(nèi)。 1射精量 2色澤、氣味 3云霧狀的觀察,46,（二）精子密度的檢查（顯微鏡觀測法）及活率評分 1檢查精子的密度 密在整個視野中精子的密度很大，彼此之間空隙很小，看不清各個精子個體運(yùn)動的情況。每毫升精液含精子數(shù)約在10億個以上。登記時以“密”字。 中精子之間空隙明顯，精子彼此之間的距離約有一個精子的長度，有些精子的活動情況清楚可見。這種精液的

20、密度評為“中”，每毫升所含精子數(shù)約210億個之間。登記時以“中”字。 稀視野中精子稀疏、分散，精子之間的空隙超過一個精子的長度。這種精液每毫升所含精子數(shù)在2億以下。登記時以“稀”字。,47,2評定精子的活率 必須于采精后立刻在25左右的實驗室內(nèi)進(jìn)行，最好在37保溫箱內(nèi)或加熱的載物臺上進(jìn)行。在評定精子活率的同時也可以測定精子的密度。 用玻璃棒蘸取一滴原精液或經(jīng)稀釋的精液（馬、豬精液的精子密度低，不須稀釋；而牛、羊精液的密度大，須用0.9%氯化鈉溶液稀釋，其溫度須與精液密度相近），滴在潔凈的載玻片上，蓋上潔凈的蓋玻片，其間充滿精液，不存留氣泡。也可滴在蓋玻片上翻放于凹玻片的凹窩上。置于顯微鏡下，放

21、大250400倍檢查。注意顯微鏡的載物臺須放平，最好是在暗視野中觀察。,48,（三）死活精子百分率測定： （1）將5%的伊紅和1%的苯胺黑按1:1混勻，分裝于12ml容量的試管中（加入試管容量的1/2），并在37水浴中加溫，隨后加入原精液13滴，搖勻后再放回水浴中，3min后立即取出待用。 （2）從以上混合液中用火柴棍沾上一小滴于載玻片的一端，用另一載玻片進(jìn)行推動制成抹片，待干燥后，高倍鏡鏡檢（500600倍）。抹片時，最好在3540的條件下制作，而且制作過程要快。,49,實驗七 精子密度計數(shù)檢查及精子生理特性的測定,一、目的和要求 由于目測法不夠準(zhǔn)確，所以采用精子計數(shù)的方法測定1ml精液內(nèi)的

22、精子數(shù)。 要求要熟練掌握此法，它是目前許多簡單而實用方法的基礎(chǔ)。,50,二、精子呼吸強(qiáng)度的測定,（一）材料和設(shè)備 1新鮮的?；蜓蚓海ㄆ渌倚笠部桑?。 2器材：毛細(xì)玻璃管、載玻片、小燒杯、水浴鍋、試管、試管架、滴管。 3試劑：美蘭溶液：取美蘭100mg，溶解于100ml的1%NaCl溶液中，然后置于容量瓶內(nèi)保存三天，再用1%NaCl溶液稀釋10倍。 （二）方法和步驟 取美蘭溶液與精液各一滴于載玻片上?；靹蚝?，吸入到兩段毛細(xì)管中約23cm，一段置于3740條件下，另一段置于10條件下，比較和觀察美蘭退色所需要的時間。,51,三、精子密度的計數(shù)檢查,（一）器材 普通顯微鏡、血球計數(shù)器、紗布、95%

23、酒精、乙醚、3%NaCl、保溫瓶、溫度計、藥棉、試管、滴管等。,52,（二）器材介紹,1介紹血球計數(shù)室的構(gòu)造（用多媒體或投影儀）。 2介紹血球吸管的構(gòu)造及各種家畜應(yīng)該使用何種血球吸管（紅血球吸管或白血球吸管）。 （1）牛、羊、雞的精液（密度高）用紅血球吸管：若將精液吸至“0.5”刻度處，然后再吸3% NaCl至“101”刻度，為稀釋200倍。如將精液吸至“1.0”刻度處，再吸3%NaCl至“101”刻度，則為稀釋100倍。 2）豬、馬、兔的精液（密度低）用白血球吸管：若將精液吸至“0.5”刻度處，然后再吸3%NaCl至“11”刻度，為稀釋20倍。如將精液吸至“1.0”刻度處，再吸3%NaCl至

24、“11”刻度，則為稀釋10倍。,53,（三）方法和步驟,1將計數(shù)室推上蓋玻片。 2將蓋好蓋玻片的計數(shù)板置于低倍鏡下觀察，首先要求找到清晰的計數(shù)室。 3用血球吸管吸精液，用藥棉擦去吸管尖端外圍附著的精液，并用3%NaCl稀釋，因不同的家畜用不同的吸管稀釋。 4吸管吸好精液和3%NaCl以后，用拇指及食指堵住吸管兩端進(jìn)行來回的充分搖動，混勻。然后棄去吸管中的前兩滴，再將吸管尖端置于血球計數(shù)室和蓋玻片交界處的邊緣上，吸管內(nèi)的精液自動滲入計數(shù)室內(nèi)，使之自然、均勻地分充滿計數(shù)室。注意不要使精液溢出蓋玻片，也不可因精液不足而使計數(shù)室內(nèi)有氣泡或干燥處，否則，應(yīng)重新操作。靜放2分鐘，開始計數(shù)。 5鏡檢和計數(shù)：

25、移到高倍鏡下檢查。 首先數(shù)出四角和正中間的五個方格中的精子數(shù)，也就是80個小方格中的精子數(shù)。載物臺要平置，不能斜放。光線不必過強(qiáng)。,54,（四）注意事項： 1若精子壓計數(shù)室的線，則以精子頭為準(zhǔn)，按照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則計數(shù)。 2為了減少誤差，應(yīng)對同一樣品做23次重復(fù)，求其平均值。如果計數(shù)的結(jié)果相差較大，則應(yīng)進(jìn)行再次檢查。,55,四、作業(yè),寫出實驗過程及其精子計數(shù)結(jié)果。,56,實驗八 精子形態(tài)和畸形率的測定,一、目的和要求 由于所需時間等原因，無需對每次采精進(jìn)行精子畸形率的測定。但應(yīng)當(dāng)每月對每一頭種公畜進(jìn)行一次畸形率的測定，以繪出精子畸形率變化圖。 畸形率突然增高，表明存在問題，應(yīng)當(dāng)

26、查找和分析原因?；温试?5以內(nèi)，受精力一般不受影響?；尉右话悴槐憩F(xiàn)前進(jìn)運(yùn)動，因而隨著畸形精子數(shù)增多，精子活率下降。如在檢查精子運(yùn)動力時，可觀察到許多畸形精子，也需要進(jìn)一步作形態(tài)學(xué)檢查。 通過本實驗，了解家畜精液中精子形態(tài)與精液品質(zhì)的關(guān)系，掌握精子形態(tài)的分類和分析方法。,57,二、材料和儀器設(shè)備,精液、染色液、高倍顯微鏡、相差顯微鏡等。,58,三、方法和步驟,（一）威廉氏染色法：觀察精子頭部形態(tài)的染色方法。 1染色液 復(fù)紅（又稱品紅）染色液： 復(fù)紅原液（10g復(fù)紅溶于100ml 96的酒精）10ml加5的石碳酸（苯酚）100ml。 取上述混合液50ml加飽和伊紅酒精溶液25ml放置兩周后即

27、可使用。 美蘭（又稱甲基蘭）染色液： 美蘭溶液（10g美蘭溶于1000ml 96的酒精中）30ml加0.01KOH 100ml過濾后再加入3倍量的蒸餾水，混合后即可使用。,59,2染色程序 （1）先制作精液抹片，要求薄而均勻。然后風(fēng)干或用酒精燈火焰固定。 （2）浸入無水酒精中固定23min，取出風(fēng)干。 （3）浸入0.5氯胺T中12min。 （4）用清水洗12min。 （5）迅速通過96的酒精、風(fēng)干。 （6）放入石碳酸復(fù)紅染色液中1015min。清水中沾2次。 （7）迅速通過美蘭染色液。 （8）水洗后風(fēng)干,60,（二）蘇木精伊紅染色： 用以觀察精液中非精子有形成分的類型和比例。細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)

28、胞漿呈紅色。 蘇木精溶液： 2g蘇木精溶于100ml無水酒精中，加入100ml蒸餾水，100ml甘油，3g冰醋酸和10g鋁酸鉀混合，放置14天后使用，用前震蕩。 伊紅染液： 1g伊紅加入100ml 95的酒精，染色時，取一定量的該液加入等量70的酒精。,61,2染色程序 （1）制備間斷式的精液抹片（即當(dāng)推制抹片時，不要一推到底，而要斷續(xù)前推，使抹片厚度有一個梯度變化，染色后易于觀察不同類型的精子成分），風(fēng)干。 （2）浸入無水酒精中固定35min，風(fēng)干。 （3）分別浸入95、75的酒精和蒸餾水中各1min。 （4）浸入蘇木精染色液中5min。 （5）浸入伊紅染色液中12min。 （6）水洗13m

29、in。 （7）通過70和無水酒精。 （8）風(fēng)干后，用二甲苯加蓋片封存。如不保存，直接觀察。,62,（三）精子尾部形態(tài)的觀察 1福爾馬林緩沖液的制備 將21.82g二水磷酸氫二鈉和22.25g磷酸二氫鉀分別溶于500ml蒸餾水中，取200ml磷酸氫二鈉溶液加80ml磷酸二氫鉀溶液，配成緩沖液。取該緩沖液100ml，加入40（V/V）福爾馬林溶液62.5ml，最后加蒸餾水至500ml。 2觀察程序 （1）將福爾馬林緩沖液注入容量為1ml的小玻璃管中，然后置37恒溫箱中備用。 （2）根據(jù)原精液的濃度，向裝有福爾馬林緩沖液的小管中注入25滴精液充分混合。 （3）取一滴混合后的精液置于載波片上，加蓋片后

30、靜止數(shù)分鐘?？稍?00倍的相差顯微鏡下觀察精子尾部的形態(tài)。隨機(jī)觀察400個精子，計算各種尾部畸形精子所占的比例。,63,（四）精子形態(tài)的分類 1頭部畸形的精子 包括：窄頭、頭基部狹窄、梨形頭、圓頭、巨頭、小頭、頭基部過寬、雙頭、頂部脫落等。但以前六種居多。 2尾部畸形精子 包括：帶原生質(zhì)滴的精子（近端、遠(yuǎn)端）、無頭的尾（它和無尾的頭往往是一個精子的兩部分，在分析時一般算作尾部的畸形）、單卷尾、多重卷尾、環(huán)形卷尾、雙尾等。 3中段畸形 包括：頸部腫脹、中段纖絲裸露、中段呈螺旋狀、雙中段等。,64,（五）非精子有形成分 多為精子形成過程中的某些退化物，生殖上皮的脫落物和血細(xì)胞等。這些成分在精液中出

31、現(xiàn)的比例和類型在一定程度上能反映睪丸和精液排出管道的生理狀態(tài)。 在精液中經(jīng)常出現(xiàn)的有：白細(xì)胞、紅細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞等。,65,四、作業(yè),繪出你所觀察到的各類畸形精子。,66,實驗九 精子頂體染色觀察,一、目的和要求 頂體在精子受精過程中起著重要的作用。因它能釋放蛋白質(zhì)分解酶消化卵丘細(xì)胞之間的粘合基質(zhì)，使精子能夠通過卵的被膜進(jìn)行受精。由于頂體結(jié)構(gòu)的畸形，可導(dǎo)致受精率降低或者不受精。精子老化或損傷，會引起頂體帽破壞，先是頂體嵴部分變化，最后整個頂體消失。這些變化可用電鏡觀察到。但用微分干涉差顯微鏡及相差顯微鏡也能看到。 精液冷凍解凍會損傷一些精子，重要的是要準(zhǔn)確知道受傷精子百分?jǐn)?shù)。優(yōu)質(zhì)奶牛精液冷凍

32、前，約90精子具有完整的頂體。冷凍后下降至6065。研究表明，頂體完整率和不返情率之間比精子活率與不返情率之間相關(guān)性更強(qiáng)。因而，檢查精子頂體完整率很重要。 通過本實驗，1）學(xué)習(xí)精液抹片染色技術(shù)；2）觀察正常精子頂體和異常精子頂體形態(tài)，計算精子頂體完整率。,67,二、材料和儀器設(shè)備,（一）二人一組，每組所需材料及器材： 燒杯2個（大小均可，用于清洗染色片用）； 玻璃滴管2支； 小磁盤、染色架各一個； 衛(wèi)生紙（墊在小磁盤內(nèi)，以免磁盤被顏色污染）； 玻璃平皿1個； 切片盒一個； 血球計數(shù)器2個； 普通光學(xué)顯微鏡1臺； 鑷子1把。,68,（二）公用器材 酒精棉球； 姬姆薩（Giemsa）原液（預(yù)先一個

33、月前配好）； 固定液； 擦鏡紙； 精液； 蒸餾水； 玻璃移液管； 玻璃滴管2支，小鑷子2把； pH試紙； 玻璃棒2支。,69,（三）試液的配制,1磷酸鹽緩沖液： Na2HPO412H2O 2.2g NaH2PO42H2O 0.55g 先用少量蒸餾水溶解，再用蒸餾水定容至100ml 用pH試紙測 pH值，應(yīng)為7.07.2。 2福爾馬林磷酸鹽固定液： （1）Na2HPO412H2O 2.25g NaH2PO42H2O 0.55g 置于100ml容量瓶中，加入0.89NaCl溶液約30ml，使之溶解。 （2）加入甲醛MgCO3飽和液8ml 甲醛MgCO3飽和液配制方法：在500ml福爾馬林（40甲醛

34、）中加入8g MgCO3。此飽和液必須在一周前配好。 （3）用0.89NaCl溶液少許沖洗裝過甲醛的量筒置于容量瓶中，并定容至100ml。此液配好后，第二天即可用。一般在室溫下保存。此液pH 為7.07.2。,70,3Giemsa原液： Giemsa原料：1g 甘油：66ml 甲醇：66ml 將Giemsa染料置于研缽中，先加入少量溫?zé)幔?0）的甘油，充分研磨至無顆粒呈漿糊狀。再將剩余甘油全部倒入，置56恒溫箱中保溫2小時。分次用甲醇清洗容器于棕色瓶中保存。保持一個月后才能使用。此原液放置時間越長越好，但使用前需經(jīng)過濾。 4Giemsa染液：必須在染色前配制。 Giemsa原液:緩沖液:蒸餾水

35、的比例為2 : 3 : 5。,71,三、頂體染色方法步驟,先準(zhǔn)備潔凈的載波片。用洗滌靈擦洗，清水沖洗，在用蒸餾水漂洗，以不掛水珠為凈。烘干或涼干備用。 1抹片 2風(fēng)干 3固定 4水洗 5染色 6水洗,72,四、精子頂體觀察 將精液染片置于顯微鏡下，先用低倍鏡找到精子，再在1000倍下進(jìn)行油鏡觀察。精子頂體呈紫色，包圍精子頭前部。 根據(jù)精子頂體完整和損傷與否，將精子頂體形態(tài)分為4種類型： 1頂體完整型 2頂體膨脹型 3頂體破損型 4頂體全脫型,73,五、作業(yè) 分析制片染色的質(zhì)量。觀察各種類型精子頂體形態(tài)。統(tǒng)計精子頂體完整率。,74,實驗十 家畜精液的冷凍,一、目的和要求 通過實驗，了解家畜精液冷

36、凍保存的基本操作和流程，初步掌握家畜精液冷凍和解凍的基本方法。,75,二、材料和儀器 牛和豬的精液樣品、液氮罐、鋁飯盒、燒杯、試管、冰箱、水浴箱、低溫溫度計、顯微鏡、蓋玻片、載玻片等。,76,三、內(nèi)容和方法,（一）牛精液的冷凍 1冷凍稀釋液的配制 12蔗糖液 75ml 卵黃 20ml 甘油 5ml 青霉素 1000IU/ml 鏈霉素 1000IU/ml 2解凍液的配制 檸檬酸鈉 2.9g 蒸餾水 100ml 配好后過濾，煮沸消毒。,77,3精液的稀釋與平衡 稀釋前先檢查精液的活率，一般不低于0.7，密度應(yīng)在8億/ml左右，用與精液同溫的稀釋液作25倍稀釋。將稀釋后的精液用棉花包裹放入冰箱內(nèi)緩慢

37、降溫到05，并保持24h。 4滴凍和保存 用吸管吸取平衡后的精液滴于用液氮冷卻到-100左右的鋁飯盒的表面（飯盒表面距液氮面23cm），制成0.1ml劑量的冷凍顆粒。滴凍要求快速、均勻，滴凍結(jié)束應(yīng)使精液顆粒停留3min，待顆粒由黃變白，即可將飯盒蓋浸入液氮。然后用青霉素瓶或紗布袋收集顆粒，作好標(biāo)記，投入液氮罐中保存。,78,5解凍 在1ml容量的試管內(nèi)裝入2.9的檸檬酸鈉解凍液1ml，放入4的水浴中，隨后取12粒精液投入試管中，立即搖動直至顆粒溶化再取出試管，取樣觀察，凡活率在0.3以上即為合格。,79,（二）豬精液的冷凍,1、冷凍稀釋液和解凍稀釋液的配制,80,1、冷凍稀釋液 12%蔗糖溶液 75ml 氨基乙酸 0.5g 檸檬酸鈉 0.5g Tris 0.2g 卵黃 20ml 雙重蒸餾水加至100ml 甘油最終濃度1% 青、鏈霉素500-1000g/ml。 配制12%蔗糖溶液，并加入氨基乙酸，檸檬酸鈉和Tris后過濾煮沸15分鐘消毒