1、昆蟲線粒體基因組研究方法,一. 昆蟲線粒體基因組的研究意義,（一） 適合做進(jìn)化生物學(xué)研究。被廣泛用于研究基因組結(jié)構(gòu)和功能、群體遺傳結(jié)構(gòu)，譜系地理學(xué)和各種分類學(xué)水平上的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。 （二）功能基因的研究,二. 研究方法,（一）獲取待研究昆蟲的線粒體基因組 （二）對(duì)線粒體基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析 （三）與其他昆蟲線粒體基因組進(jìn)行比對(duì) （四）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,具體步驟,1. 采集標(biāo)本并冷凍 2. 提取DNA 3. 擴(kuò)增線粒體基因組上的經(jīng)典片段 4. 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其他片段 5. 將所有片段拼接成完整的線粒體組（環(huán)形） 6. 校對(duì)數(shù)據(jù)，利用軟件、比對(duì)等方法，標(biāo)出tRNA、16S、12S及13個(gè)蛋白質(zhì)基

2、因的位置，上傳線粒體基因組數(shù)據(jù)至Genbank。 7. 對(duì)tRNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 8. 對(duì)12S及16S進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 9. 對(duì)該昆蟲線粒體基因組上特殊位置進(jìn)行討論 10. 系統(tǒng)發(fā)育分析,1. 采集標(biāo)本及冷凍,利用高壓汞燈及黑光燈誘集，然后將標(biāo)本低溫冷凍致死，取一側(cè)后足泡入無水乙醇，置于-20度冰箱保存，供提取DNA。標(biāo)本展翅并保存，以待進(jìn)一步形態(tài)鑒定。,2. DNA提取,總DNA提取試劑盒為德國默克公司QIAGEN DNeasy Tissue kit。PCR試劑使用TIANGEN天根生化科技有限公司生產(chǎn)的PCR MasterMix。 將浸泡于無水乙醇中的足取出，晾干，分成2-3段，放在1.5ul

3、的離心管中。按照QIAGEN DNeasy Tissue kit使用手冊(cè)的說明進(jìn)行總DNA提取。抽提的DNA溶于200-300ul的AE緩沖液，并置于在-20冰箱保存?zhèn)溆谩?3. PCR擴(kuò)增和測(cè)序,先擴(kuò)增線粒體基因組上的經(jīng)典片段，如CO、CO、CO、Cob等。 例：擴(kuò)增COI基因片段 擴(kuò)增引物為通用引物L(fēng)COI490（5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3）和HCO2198（5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3）（Folmer et al , 1994）。反應(yīng)體系為25l，其中上下游引物各0.5l，PCR MasterMix 12.5l ，DNA模板

4、3l，ddH2O 8.5l。擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性94 2分鐘，變性94 1分鐘，退火50 1分鐘，延伸72 1分鐘, 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。取3l PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖膠電泳檢驗(yàn)。PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。,4. 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其他片段,利用軟件Primer5.0 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其他片段。最難擴(kuò)增的片段是控制區(qū)（A+T-rich）。因?yàn)橐锖茈y設(shè)計(jì)，所以需要花費(fèi)一些時(shí)間及精力。,5. 將所有片段拼接成完整的線粒體組（環(huán)形）,利用軟件DNAstar對(duì)擴(kuò)增好的各個(gè)片段進(jìn)行拼接。用Bioedit軟件查看測(cè)序原始峰圖，校對(duì)各個(gè)堿基。將校對(duì)好的數(shù)據(jù)上傳至Genbank。獲取Genbank的accession number。,6. 尋找tRNA及預(yù)測(cè)tRNA結(jié)構(gòu),用tRNAscan-SE Search Server 在線軟件，尋找tRNA，一次可找出17-19個(gè)。其余與其他昆蟲線粒體進(jìn)行比對(duì)找出。 用DNAsis預(yù)測(cè)tRNA結(jié)構(gòu)，對(duì)于較為特殊的tRNASer(AGN)，需手工畫出。,7. 預(yù)測(cè)12S及16S結(jié)構(gòu),用軟件XRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)不到的，用手工畫出。,8. 對(duì)特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析討論,例：控制區(qū)的結(jié)構(gòu)分析 在線軟件 Mfold Web Server (Zuker, 2003; http:/mfold