1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí) 驗(yàn) 要 求,堅(jiān)持課前預(yù)習(xí) 不遲到，不早退，更不能無故缺課； 嚴(yán)格按正確規(guī)范實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作好記錄； 保持實(shí)驗(yàn)室整潔 注意安全 事實(shí)求是地、獨(dú)立地寫好實(shí)驗(yàn)報(bào)告,實(shí)驗(yàn)報(bào)告,姓名、班級和學(xué)號 實(shí)驗(yàn)題目 實(shí)驗(yàn)原理（略寫） 實(shí)驗(yàn)操作（略寫） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 畫圖 文字描述 分析和討論 思考題,實(shí)驗(yàn)一、油鏡的使用、細(xì)菌的革蘭氏染色和細(xì)菌形態(tài)的觀察,教學(xué)目標(biāo)或要求： 鞏固和掌握顯微鏡油鏡的正確使用； 學(xué)習(xí)細(xì)菌制片和單染色技術(shù)； 觀察細(xì)菌的三種基本形態(tài)； 對人體上的微生物染色檢查，初步建立無菌操作的概念； 學(xué)習(xí)細(xì)菌的革蘭氏染色原理和方法 。,顯微鏡油鏡的使用,油鏡頭的識別和重要參數(shù) 油鏡物鏡的

2、工作原理 油鏡的使用方法和注意事項(xiàng),油鏡頭的識別和重要參數(shù),放大倍數(shù) 數(shù)值口徑 工作距離,油鏡物鏡的工作原理,使用油質(zhì)作為玻片與接物鏡之間的介質(zhì)油浸系 可以增加顯微鏡的放大倍數(shù) 可以增加視野的照明度 可以增大顯微鏡的分辨率,油鏡的使用方法和注意事項(xiàng),1、用低倍鏡對光。最大光圈 2、低倍鏡觀察（尋找觀察目標(biāo)）。適當(dāng)縮小光圈 3、高倍鏡觀察（選取理想的觀察目標(biāo)）。 4、油鏡觀察：高倍鏡觀察后- 上升鏡筒-油鏡轉(zhuǎn)至正下方，在載玻片上加一小滴油-小心地下降鏡筒使鏡頭浸在油里-用粗螺旋將鏡筒緩慢上升，尋找目標(biāo)（物象）用細(xì)螺旋調(diào)節(jié)，使物象清晰-觀察記錄。最大光圈 5、觀察完畢。上升鏡筒，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使

3、油鏡物鏡偏位。用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上的油跡，再取一張擦鏡紙醮上二甲苯擦去鏡頭上殘留的香柏油，最后再用一張干凈的擦鏡紙擦去殘留在鏡頭上的二甲苯。 6、將顯微鏡各部分還原，放回箱中。,細(xì)菌的制片與染色,單染色 復(fù)染色,染 料,堿性染料帶正電染料。其陽離子部分為發(fā)色基團(tuán)，可與細(xì)胞中帶負(fù)電的組分結(jié)合。如結(jié)晶紫沙黃, 甲基藍(lán),堿性復(fù)紅等。 酸性染料帶負(fù)電染料。其陰離子部分為發(fā)色基團(tuán)，可與細(xì)胞中帶正電的組分結(jié)合。如剛果紅、酸性復(fù)紅 等。 脂溶性染料如Sudan black。,多數(shù)染料都是中性有機(jī)鹽。據(jù)著色基的不同可分為以下類型：,涂片,干燥,固定,染色12min,水洗、吸干,鏡檢,細(xì)菌的單染色,革蘭氏染色

4、法：是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。,革蘭氏染色法基本原理,G菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)復(fù)紅復(fù)染后就成紅色。 G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色

5、。,1、活材料：培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌和蘇云金芽孢桿菌。 2、染色液和試劑：結(jié)晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸復(fù)紅 、蒸餾水、香柏油。 3、器材：載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。,實(shí)驗(yàn)材料,（1）涂片 （2）晾干 （3）固定 （4）結(jié)晶紫染色：加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1min；水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。 （5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。,方法與步驟,（6）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色1520s至流出液無色，立即水洗。 （7）復(fù)染：滴加復(fù)紅復(fù)染1min；水洗：用水洗去涂片上的復(fù)紅染色液。 （8）晾干：將染好的涂片用吸水紙吸干。 （9

6、）鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色結(jié)果。,革蘭氏染色法,操作步驟,涂片干燥固定,結(jié)晶紫1min水洗,I-KI 1min水洗,95%乙醇脫色約1520s水洗,沙黃或石炭酸復(fù)紅 1min水洗,干燥鏡檢,革蘭氏陰性桿菌,革蘭氏陽性桿菌,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,1、用石炭酸復(fù)紅對蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌進(jìn)行單染色，在顯微鏡油鏡下觀察形態(tài)； 2.用混合涂片的方法對大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌進(jìn)行革蘭氏染色 3.自選材料：用牙簽挑取牙垢觀察,1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時(shí)間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。,注意事項(xiàng),2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。 3.選用幼齡的細(xì)菌。G+菌培養(yǎng)12h-16h，E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性