1、一 實(shí)驗(yàn)意義 農(nóng)藥的使用在給農(nóng)業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，其負(fù)面效應(yīng)也日益突出，尤其是農(nóng)藥對(duì)食品和環(huán)境的污染，并通過(guò)生物富集和食物鏈的傳遞進(jìn)入人體，可造成農(nóng)藥殘留在人體內(nèi)蓄積，進(jìn)而引起各種組織器官發(fā)生病變，甚至致癌、致畸、致突變，農(nóng)藥殘留問(wèn)題已成為當(dāng)今食品安全最主要的問(wèn)題之一。DNA 是生物體內(nèi)主要的遺傳物質(zhì)，也是化學(xué)物質(zhì)作用于生物體早期階段的一個(gè)重要的靶標(biāo)。藥物分子與DNA 之間的相互作用模式主要有嵌插結(jié)合、溝槽結(jié)合和靜電結(jié)合，其中嵌插結(jié)合是形成DNA 加合物最主要的模式，DNA 加合物的形成一旦逃避生物自身的修復(fù)，就可成為致突變或致癌的最小因子而被認(rèn)為是致腫瘤過(guò)程的一個(gè)重要起始階段。事實(shí)證明

2、，在體內(nèi)與DNA 發(fā)生作用的化學(xué)物質(zhì)都能在一定程度上在體外與DNA 發(fā)生作用。具有選擇性的溝槽結(jié)合和嵌插作用是藥物分子與DNA 相互作用研究的重點(diǎn)1 。熒光分析法和吸收光譜法是一種最常用的分析方法，這方面的工作有更多的文獻(xiàn)報(bào)道2。溴化乙錠(EB)是一種研究DNA的最靈敏的熒光探針之一，關(guān)于它們與DNA的鍵和特性已有詳盡的報(bào)道，水溶液中EB的熒光量子產(chǎn)率小，當(dāng)鍵合到DNA上后，其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且其激發(fā)波長(zhǎng)有明顯的紅移。EB已作為一種典型的平面嵌入劑，用來(lái)對(duì)比討論各種熒光分子與DNA的作用方式。通過(guò)熒光光譜等研究農(nóng)藥小分子與DNA的相互作用，求得了結(jié)合常數(shù)，取得了相關(guān)信息，從分子水平上探討了其作用

3、方式。二 研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)2.1 研究現(xiàn)狀相互作用分析的研究目前在國(guó)內(nèi)外都是較為熱門(mén)的課題，所采用的研究手段主要有：光譜分析、波譜分析、表面等離子體激元共振(SPR)、電化學(xué)分析拍j、親和毛細(xì)管電泳分析72(ACE)、原子力顯徽鏡(AFM)法、量熱法等儀器分析方法。其中的光譜法包括熒光分光光度法、紫外可見(jiàn)分光光度法、紅外光譜法、圓二色光譜法、拉曼光譜法、x射線衍射等。汪佳蓉，張國(guó)文等1采用紫外- 可見(jiàn)光譜法、熒光光譜法并結(jié)合溴化乙錠(EB)熒光探針、黏度測(cè)定、鹽效應(yīng)、磷酸鹽效應(yīng)和KI 熒光猝滅實(shí)驗(yàn)，研究倍硫磷（有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑）與小牛胸腺DNA 的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA 對(duì)倍硫磷內(nèi)源性熒光產(chǎn)

4、生強(qiáng)烈的猝滅作用。李來(lái)生2等采用阿霉素?zé)晒馓结樠芯克苄詫?duì)一二甲氨甲基一杯芳烴與小牛胸腺DNA相互作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：DNA能猝滅阿霉素的熒光。杯幅1胺能與DNA的磷氧負(fù)離子強(qiáng)烈作用，并以嵌入與靜電位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)混合模式影響DNA一阿霉素。宮霞3等利用熒光光譜方法，以溴化乙錠(EB)熒光探針研究家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽MDL一1與大腸桿菌染色體DNA的相互作用，探討其作用模式為溝槽式和嵌入式混合模式。并計(jì)算出其結(jié)合常數(shù)和成鍵位點(diǎn)數(shù)。鄭朝華4等利用熒光光譜法，研究左氧氟沙星與DNA間的相互作用模式。小牛胸腺DNA對(duì)左氧氟沙星的熒光具有強(qiáng)烈的猝滅作用。經(jīng)計(jì)算得出結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，并推斷兩者之間為溝槽作用模式。張勇

5、5等采用熒光光譜法，利用血卟呤及金屬血卟啉對(duì)甲氧卞氨嘧啶的識(shí)別作用，建立起靈敏的血卟啉分析方法，并求得結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。2.2 發(fā)展趨勢(shì)藥物的熒光分析法6進(jìn)展：常用的藥物分析方法有重量分析法、滴定分析法、色譜分析法（包括柱色譜法、紙色譜法、薄層色譜法、離子交換色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、固相微萃取、高效毛細(xì)管電泳等）、光化學(xué)分析法（包括紅外和紫外 可見(jiàn)分光光度法、熒光光譜法、化學(xué)發(fā)光法、磷光分析法、原子吸收光譜法、質(zhì)譜法、共振光散射等）、電化學(xué)分析法等 熒光法以其靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)受到分析工作者的青睞 將熒光光譜分析法應(yīng)用于藥物分析，已在藥物有效成分分析鑒定、藥物代

6、謝動(dòng)力學(xué)研究、臨床藥理與藥效分析等方面取得長(zhǎng)足發(fā)展，并廣泛應(yīng)用于生化分析、生物醫(yī)學(xué)、臨床分析等領(lǐng)域的痕量分析。常規(guī)熒光分析法最早被應(yīng)用于分析抗瘧疾藥物奎寧， 隨著熒光分析法的發(fā)展，其應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，被廣泛用于抗菌素藥物、止痛藥、鎮(zhèn)靜劑、止血藥等的分析，涉及合成藥物、生物藥物和天然藥物， 由于自身具有發(fā)射熒光特性的物質(zhì)相對(duì)較少，并且受到拉曼峰和散射光等背景的干擾，常規(guī)熒光分析法在藥物分析中的應(yīng)用受到限制， 為使熒光分析法的應(yīng)用更加廣泛，發(fā)展了各類(lèi)熒光分析方法，如對(duì)不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過(guò)某類(lèi)化學(xué)反應(yīng)使其轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合測(cè)定的熒光物質(zhì)，對(duì)熒光較弱的物質(zhì)可采取熒光增敏分析法，近年來(lái)，還發(fā)展了各種新型熒光分析

7、技術(shù)，如激光誘導(dǎo)熒光法、同步熒光法、導(dǎo)數(shù)熒光法、熒光探針?lè)?、光化學(xué)熒光法、時(shí)間分辨熒光法、三維熒光法、偏振熒光法、熒光免疫測(cè)定法、熒光成像技術(shù)、熒光光纖傳感器等， 這些技術(shù)的應(yīng)用加速了各種新型熒光分析儀器的研制，使熒光分析不斷朝著高效、痕量、微觀和自動(dòng)化方向發(fā)展。隨著藥學(xué)學(xué)科的發(fā)展，人們對(duì)藥物分析的要求越來(lái)越高，因此必須運(yùn)用和發(fā)展更適當(dāng)?shù)姆治龇椒▉?lái)滿足藥物分析的要求! 今后的發(fā)展方向是：探索并提出常規(guī)藥物熒光分析新方法；與計(jì)算機(jī)技術(shù)緊密結(jié)合，研制出自動(dòng)化程度高、獲得和處理信息速度快的熒光分析儀器；發(fā)現(xiàn)和合成選擇性?xún)?yōu)良的藥物熒光試劑；與其他現(xiàn)代化分析儀器和方法聯(lián)合使用，以更準(zhǔn)確、更靈敏、更專(zhuān)一和

8、更低檢測(cè)限獲得藥物及藥物與生物大分子相互作用的有關(guān)信息。三 實(shí)驗(yàn)方案材料與方法3.1 試劑與儀器36-38%的濃鹽酸（上海振興化工廠）；Tris試劑（天津市遠(yuǎn)航化工二廠有限公司）；西維因濃度為200g/ml；鯖魚(yú)精 DNA(北京惠澤奧公司產(chǎn)品)用少量純水稀釋?zhuān)瑵舛壤?6600L/molcm 來(lái)確定，其濃度為7.510-5 mol/L，溶液保存于4的冰箱中備用； 用0.35mlHCl溶液和0.6057gTris試劑混合配成pH=7.4的Tris-HCl 緩沖溶液；2.19 10-2 mol/L 的KCl 溶液；試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。F-7000 型熒光光度計(jì) ；T6 紫外-可見(jiàn)

9、分光光度計(jì)。3.2 方法3.2.1 紫外法在紫外比色皿中，分別加入3.0mlTris-HCl 緩沖溶液和30lDNA，3.0mlTris-HCl 緩沖溶液和30l西維因，3.0mlTris-HCl 緩沖溶液和30l西維因和30lDNA，在波長(zhǎng)為200-400nm中，分別測(cè)定其光譜。3.2.2 直接熒光法在熒光比色皿中，加入3.0ml Tris-HCl 緩沖溶液和200l西維因溶液，混勻。掃描其熒光光譜后，再逐漸加入濃度為DNA 溶液(10l/ 次，共5次)，混合均勻，放置5min 后進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。3.2.3 鹽效應(yīng) 在熒光比色皿中，加入3.0ml Tris-HCl 緩沖溶液，100l西維因

10、溶液，50lDNA溶液，混勻。掃描其熒光光譜后，再逐漸加入KCl溶液(10l/ 次，共5次)，混合均勻，放置5mi n 后進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。四 結(jié)果與討論4.1紫外法 由圖可知，在pH 7.4 的Tris-HCl 緩沖條件下，測(cè)定了7.510-5 mol/L DNA 的紫外吸收曲線，西維因的紫外吸收曲線，西維因與DNA的混合物的紫外吸收曲線。發(fā)現(xiàn)DNA的紫外吸收曲線與DNA和西維因吸光度之和的曲線sum有明顯的差別，說(shuō)明西維因和DNA 之間發(fā)生了相互作用。圖一 西維因，DNA和西維因-DNA的紫外吸收光譜4.2直接熒光法 由圖2可知，在pH 7.4 Tris-HCl 緩沖溶液中，西維因具有較強(qiáng)

11、的內(nèi)源熒光，隨著DNA 加入濃度的增大，西維因的熒光強(qiáng)度有規(guī)律的猝滅，表明西維因與DNA 發(fā)生了相互作用，DNA 對(duì)西維因的熒光產(chǎn)生了猝滅效應(yīng)。圖二 DNA存在下西維因的熒光光譜4.3鹽效應(yīng) 加入KCl可知K+對(duì)西維因-DNA體系的影響，可判斷是否為靜電作用。如圖3所示，在335.2nm處最高峰和最低峰差值為105.3，差值較大，說(shuō)明K+對(duì)西維因-DNA體系的影響較大，即靜電作用也是西維因與DNA間的重要作用方式之一。圖3 KCl對(duì)西維因-DNA復(fù)合物的熒光影響4.4 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用紫外，熒光光譜法并結(jié)合鹽效應(yīng)等多種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)西維因與DNA 的相互作用模式進(jìn)行研究，推斷出西維因與DNA以靜電

12、方式進(jìn)行結(jié)合，這一研究結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(文獻(xiàn)11)結(jié)果相一致。參考文獻(xiàn)1汪佳蓉，張國(guó)文等.倍硫磷與DNA 相互作用的光譜法研究J，食品科學(xué)。2009年第30卷15期：78-81.2李來(lái)生，黃志兵，王宇曉等熒光光譜法研究對(duì)一二甲氨甲基一杯(83芳烴與DNA相互作用J光譜學(xué)與光譜分析，2004，24(11)：78813宮霞，施用暉，樂(lè)國(guó)偉熒光光譜分析家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽與大腸桿菌染色體DNA作用機(jī)理J光譜學(xué)與光譜分析，2005，25(13)：4204234鄭朝華，葉寶芬，杜迎翔等左氧氟沙星與小牛胸腺DNA相互作用的熒光光譜法研究(J中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2004，35(12)：7407435張勇，雷亞春，劉滇生血卟啉及金屬血卟啉與甲氧卞氨嘧啶相互作用的熒光光譜研究J光譜實(shí)驗(yàn)室，2004，21(3)：6096126潘祖亭，關(guān)洪亮，原華平，李微，陳果, 熒光光譜法在藥物分析中的應(yīng)用J, 吉首大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 第26卷第3期, 2005年7月.7劉崢，夏之寧等。光譜法在分子之間相互作用研究中的應(yīng)用J，激光雜志2001年第22卷,第9頁(yè)。8廖見(jiàn)培，黃杉生， DNA與小分子藥物相互作用研究進(jìn)展J，化學(xué)傳感器第25卷第l期 ,2 O 0 5年3月.9劉煒, 畢和平,