1、Molecular Biology,第一章 緒 論,分子生物學(xué),本章主要內(nèi)容,一、分子生物學(xué)的基本含義,二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容,三、分子生物學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史,四、分子生物學(xué)在獸醫(yī)上的應(yīng)用,Why?,一、分子生物學(xué)的基本含義,是從分子水平研究生命本質(zhì)，以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用為研究對(duì)象的一門新興學(xué)科。,二 、分子生物學(xué)研究?jī)?nèi)容, DNA重組技術(shù)（基因工程） 基因的表達(dá)調(diào)控 生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能研究(結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)） 基因組、功能基因組與生物信息學(xué)研究,（一）DNA重組技術(shù),目的是將不同DNA片段（如某個(gè)基因或基因的一部分）按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來(lái)

2、，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生影響 受體細(xì)胞的新的 遺傳性狀。,以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過(guò) 程,目 錄,DNA重組技術(shù),1、可用于定向改造某些生物的基因組結(jié)構(gòu)，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值； 2、可被用于大量生產(chǎn)某些在正常細(xì)胞代謝中產(chǎn)量很低的多肽 ； 3、可被用來(lái)進(jìn)行基礎(chǔ)研究 。,（二）基因的表達(dá)調(diào)控,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究 轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor ）研究 RAN剪接,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究,轉(zhuǎn)錄因子研究,真核生物帽子結(jié)構(gòu)的加入在細(xì)胞核內(nèi)完成，而且是在RNA鏈開(kāi)始合成后即加入。,真核基因結(jié)構(gòu)的不連續(xù)性,真核基因結(jié)構(gòu)的不連續(xù)性,RNA剪輯,RNA剪輯,（三）生物

3、大分子的結(jié)構(gòu)功能研究,生物大分子在發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)，必須具備兩個(gè)前提： A 它擁有特定的空間結(jié)構(gòu)（三維結(jié)構(gòu)） B 在它發(fā)揮生物學(xué)功能的過(guò)程中，必定存在著結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化。,（四）基因組、功能基因組與生物信息學(xué)研究,基因組:一個(gè)細(xì)胞（或生物體）內(nèi)所有基因的組合 功能基因組學(xué)：研究基因組內(nèi)每個(gè)基因的具體功能及其相互關(guān)系 蛋白質(zhì)組計(jì)劃：后基因組計(jì)劃，研究蛋白質(zhì)的組成、功能 生物信息學(xué)：以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析,人染色體及其標(biāo)準(zhǔn)帶紋 （常染色體和性染色體）,染色體DNA氨基酸,三、分子生物學(xué)簡(jiǎn)史,20世紀(jì)70s以后,20世紀(jì)50s至20世紀(jì)70s,19世紀(jì)至20世紀(jì)50年代,改造生

4、命的發(fā)展階段,初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì),建立和發(fā)展階段,準(zhǔn)備和醞釀階段,（一）準(zhǔn)備和醞釀階段,產(chǎn)生了兩點(diǎn)對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)上的重大突破：即確定了蛋白質(zhì)是生命的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和生物遺傳的物質(zhì)是DNA。,蛋白質(zhì)是生命的主要物質(zhì)基礎(chǔ),1897年，Buchner兄弟用不含細(xì)胞的酵母 提取液，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵，提出酶是生物催化劑。 1902年Email Fisher證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 是多肽。 1953年Sanger和Thompson完成了第一 個(gè)多肽分子 -胰島素A鏈和B鏈的氨基酸 全序列分析。 1950年P(guān)auling和Corey提出了-角 蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)模型。,生物遺傳的物質(zhì)是,基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，,B

5、acterial Strain,Injection,1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化因子實(shí)驗(yàn),1952年Hershey和Chase證實(shí)噬菌體DNA侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn),（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段,1 中心法則的建立和完善,50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō),成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。,Jacob and Monod,2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的深入研究,一個(gè)堿基突變氨基酸變異蛋白質(zhì)變異人類疾病 （鐮

6、刀性貧血?。汗劝彼崂i氨酸）,但是，如果沒(méi)有分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學(xué)家就無(wú)法對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。,（三）初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并開(kāi)始改造生命的深入發(fā)展階段,兩大技術(shù)保證：,1.DNA的體外切割和連接,1962年Arber 發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了 DNA 連接酶DNA ligase covalently links two DNA strands,Herbert Boyer, Stanley Cohen 1972年獲得第一個(gè)重組DNA分子,Herbert Boyer,重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的主要工具酶,到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子

7、切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開(kāi)，以供下一步研究。,1972 - Paul Berg,Produced first recombinant DNA using EcoRI,EcoRI recognition sites, phage DNA,EcoRI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The two fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recombinant DNA,僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割

8、和重組遠(yuǎn)不能滿足基因研究的需要。 DNA片段在體外不具備自我復(fù)制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。 這就是基因克隆，或分子克隆 。,分子克隆的載體-具備自主復(fù)制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。,從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。,1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量氯化鈣處理后，能有效地吸收噬菌體DNA。,1972年，Cohen等人又報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。,1973 - Bo

9、yer, Cohen & Chang,Transform E. coli with recombinant plasmid,Stanley Cohen & Annie Chan,Herbert Boyer,Kanamycin resistance gene,Plasmid pSC101,Tetracycline resistance gene,E. coli transformed with recombinant plasmid,Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline,Only cells wi

10、th recombinant plasmid survive to produce colonies,(1)從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。,（2）像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)；,（3）質(zhì)粒DNA-大腸桿菌細(xì)胞作為一種成功的基因克隆體系，有可能在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。,DNA的核苷酸序列分析技術(shù),DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來(lái)的一門重要的DNA技術(shù)學(xué)，這門技術(shù)，對(duì)于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價(jià)值。,四、分子生物學(xué)

11、的應(yīng)用,品種改良,轉(zhuǎn)基因牛 作為生物反應(yīng)器 改善牛奶的品 質(zhì)，提高酪蛋白 含量 轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)激素基 因，提高產(chǎn)奶量,轉(zhuǎn)基因羊 獲得人的凝血酶原激活劑、凝血因子、尿激酶等。 改變羊毛的顏色。,轉(zhuǎn)基因豬 生長(zhǎng)激素基因 人的血紅蛋白基因,提高畜牧業(yè)的生產(chǎn)力發(fā)展水平,分子生物學(xué)在獸醫(yī)中的應(yīng)用,分子生物學(xué)技術(shù)在中獸醫(yī)基礎(chǔ)理論中的應(yīng)用,陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)與分子生物學(xué)技術(shù) 陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)貫穿于中獸醫(yī)學(xué)理論體系的各個(gè)方面。對(duì)分子生物學(xué)的主要研究對(duì)象核酸和蛋白質(zhì)及與其密切相關(guān)的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行了陰陽(yáng)屬性的劃分。核酸屬陰，蛋白質(zhì)屬陽(yáng)；胞核屬陰，胞質(zhì)屬陽(yáng)。 近幾年來(lái)，我國(guó)對(duì)cAMP、cGMP與中獸醫(yī)陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)進(jìn)行了研究。李芳生報(bào)道，陽(yáng)

12、虛者cAMP水平升高；陰虛者cGMP水平升高。進(jìn)一步分析cAMP、cGMP與陰虛和陽(yáng)虛的關(guān)系可知，陽(yáng)虛者表現(xiàn)副交感神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)加強(qiáng)；陰虛者主要表現(xiàn)交感神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)加強(qiáng)。這些研究都為推動(dòng)中醫(yī)理論向現(xiàn)代化邁進(jìn)有重要意義。 素問(wèn)至真要大論中說(shuō)“謹(jǐn)察陰陽(yáng)所在而調(diào)之，以平為期”，是中醫(yī)臨床診斷和治療的基本原則。與此理論相一致，分子生物學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞染色體上存在非活化狀態(tài)的原癌基因，同時(shí)還存在抑癌基因。如前者激活，基因異常表達(dá)；或后者缺失而不能發(fā)揮正常細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和終止分化作用，就可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，這說(shuō)明原癌基因與抑癌基因兩者平衡失調(diào)對(duì)腫瘤發(fā)生起著重要作用。,臟腑學(xué)說(shuō)與分子生物學(xué)技術(shù),臟腑學(xué)說(shuō)是研

13、究動(dòng)物機(jī)體各臟腑器官的生理活動(dòng)、病理變化及其相互關(guān)系的學(xué)說(shuō)。 腎藏精，主命門之火，是機(jī)體的先天之本。楊金蓉運(yùn)用“恐傷腎”原理恐嚇母鼠，造成子鼠先天腎氣虧虛的動(dòng)物模型，然后檢驗(yàn)子鼠胸腺核酸含量，發(fā)現(xiàn)恐嚇各組DNA、RNA含量及RNADNA值均有所降低，且恐嚇程度越重，降低越明顯。王米渠報(bào)道受驚嚇母鼠所產(chǎn)子鼠大腦皮層厚度變薄，尤以分子層明顯變薄，說(shuō)明圍產(chǎn)期緊張情緒直接影響到下一代子鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。用RTPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)腎陽(yáng)虛證和下丘腦室旁核促腎上腺皮質(zhì)激素的mRNA表達(dá)受抑，將腎陽(yáng)虛證定位在下丘腦。脾統(tǒng)血，主運(yùn)化，是機(jī)體的后天之本。王曉明等通過(guò)脾氣虛證大白鼠模型及其相關(guān)抗氧化酶變化研究，提示中醫(yī)認(rèn)為“

14、脾為后天之本”在生理上同分子生物學(xué)水平的抗氧化酶活性和(含量)的正常，對(duì)中醫(yī)“脾”的本質(zhì)的現(xiàn)代化科學(xué)解釋有一定的學(xué)術(shù)意義。這一切都說(shuō)明中醫(yī)臟象學(xué)說(shuō)是有分子生物學(xué)基礎(chǔ)的。,中獸醫(yī)證的研究與分子生物學(xué)技術(shù),中獸醫(yī)中的同病異治、異病同治在分子生物學(xué)上的體現(xiàn)就是將同一疾病不同證候和同一證候不同疾病的動(dòng)物進(jìn)行基因圖譜表達(dá)，觀察分析其基因突變、異常表達(dá)同疾病的關(guān)系。從中西醫(yī)結(jié)合的角度，中醫(yī)證本質(zhì)的含義是指引起證發(fā)生發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，這些物質(zhì)決定著證的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。 分子生物學(xué)對(duì)于蛋白質(zhì)研究的突破將為證候與蛋白質(zhì)的結(jié)合研究奠定基礎(chǔ)，在這一方面，有關(guān)蛋白質(zhì)芯片的深入研究和納米技術(shù)的使用將為蛋白質(zhì)的研究與中醫(yī)證候

15、的研究提供發(fā)展的契機(jī)。而證候一基因組學(xué)也是中醫(yī)現(xiàn)階段研究的一個(gè)重要課題，將宏觀的中醫(yī)證候與微觀的基因功能相聯(lián)系。為中醫(yī)證候的現(xiàn)代化研究提供了新的探索路徑。,發(fā)現(xiàn)“陽(yáng)虛”動(dòng)物骨髓細(xì)胞DNA合成率下降，認(rèn)為中醫(yī)腎主骨生髓藏精理論與促進(jìn)核酸蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。 通過(guò)對(duì)中藥抗衰老作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度縮短與衰老有關(guān)。端粒是線形染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，含有DNA高度重復(fù)序列，隨著細(xì)胞的衰老，血液及結(jié)腸黏膜細(xì)胞中端粒的平均長(zhǎng)度在不斷減少，抗衰老中藥的作用可能表現(xiàn)在對(duì)端粒DNA重復(fù)序列有保護(hù)作用。而中藥通過(guò)提高DNA的修復(fù)能力、清除自由基、增強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NCF)受體等作用來(lái)達(dá)到抗衰老之目的。,分子生物學(xué)技

16、術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用,1994年，Wilkins和Williams首先提出了蛋白質(zhì)組。化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是利用化學(xué)小分子直接從功能角度切入蛋白質(zhì)組的研究，通過(guò)化學(xué)小分子處理前后的差異蛋白質(zhì)組展示，研究蛋白質(zhì)的翻譯后修飾過(guò)程。這種研究模式為中藥對(duì)機(jī)體的作用機(jī)制提供了研究平臺(tái)。 分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于中藥藥理的研究開(kāi)始于中藥單體的研究，集中于人參三醇皂苷、云芝多糖等中藥單體對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子及受體mRNA轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)上有調(diào)控作用。對(duì)于中藥復(fù)方的研究尚處于起步階段。我國(guó)學(xué)者曾對(duì)人參、黃芪、青蒿、淫羊藿、銀耳、靈芝等藥物對(duì)體內(nèi)重要的細(xì)胞因子(ILl、IL一2、IL一3、IL一6、TNF等)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)體

17、的免疫反應(yīng)做了探討。曹穎英等應(yīng)用斑點(diǎn)雜交法研究表明，淫羊藿苷(ICA)可促進(jìn)刀豆蛋白(ConA)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞IL一3 mRNA、IL一6 mRNA的表達(dá)初步闡明了ICA促進(jìn)某些細(xì)胞因子產(chǎn)生的分子機(jī)制。,2 分子生物學(xué)軟件在動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用,分子生物學(xué)作為基礎(chǔ)學(xué)科，在動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域（動(dòng)物疾病發(fā)生機(jī)理、診斷與預(yù)防）中的應(yīng)用不斷拓展，其相關(guān)應(yīng)用軟件已成為廣大研究人員必不可少的輔助工具，熟練掌握一套相關(guān)生物學(xué)軟件的使用，可以為科研工作者節(jié)省大量寶貴的時(shí)間，并起到事半功倍的效果。 ,參考文獻(xiàn)收集整理,書(shū)目資料庫(kù)管理系統(tǒng)v 11.0(Reference Manager v 11.0)。 Refer

18、ence Manager是一個(gè)專門設(shè)計(jì)來(lái)管理書(shū)目參考文獻(xiàn)的資料庫(kù)程序。收集參考文獻(xiàn)和制作書(shū)目都可以使用Reference Manager輕易地管理資料。 目前提供新資料庫(kù)可以將您收集完成的Reference Manager資料庫(kù)放在網(wǎng)絡(luò)環(huán)境中，可以通過(guò)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入您的Web Publisher網(wǎng)站檢索并建立參考文獻(xiàn)清單或輸出參考文獻(xiàn)。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施,本階段包括限制酶分析、引物設(shè)計(jì)、同源序列比較、質(zhì)粒作圖、結(jié)構(gòu)域(motif)查找、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析、克隆策略圖譜、三維結(jié)構(gòu)顯示 、電泳條帶定量分析、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析作圖等方面的內(nèi)容,3 分子生物學(xué)技術(shù)在傳染病領(lǐng)域中的應(yīng)用,（1）基因工程疫苗 重組亞單位疫苗 重組活載體疫苗 基因缺失疫苗 基因疫苗 多肽疫苗 轉(zhuǎn)基因植物疫苗,應(yīng)用基因工程首先研制出了偽狂犬病病 毒(PRV)基因工程苗 。最初， 從胸苷激酶 TK 基因編碼缺失148個(gè)核苷酸的病毒而 減毒，TK催化胸苷嘧啶脫氧核苷轉(zhuǎn)化為單 磷酸形式作為核苷合成補(bǔ)救途徑的部分物質(zhì)， 認(rèn)為這對(duì)病毒在細(xì)胞上增殖是極其重要的， 當(dāng) 在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)上培養(yǎng)時(shí)，完全不要TK， 且缺失不影響病毒的生長(zhǎng)。,然而，當(dāng)在體內(nèi)檢測(cè)時(shí)， 發(fā)現(xiàn)TK 陰性病毒嚴(yán)重地減毒，建議這作為理想的疫苗候選株，對(duì)這株TK陰性突變株來(lái)說(shuō)，減毒的基礎(chǔ)是規(guī)定的和穩(wěn)定的， 由于減毒牽涉到基