1、單克隆抗體制備工藝，臨床獸醫(yī)學(xué)系，吳黎明，0830，2110124，單克隆抗體技術(shù)的基本原理小鼠骨髓瘤細(xì)胞可以無限增殖，在體外分泌無抗體活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾細(xì)胞有產(chǎn)生抗體的能力，但不能無限增殖，還能產(chǎn)生特異性抗體，可用有限稀釋法篩選培養(yǎng)，成為單細(xì)胞增殖產(chǎn)生的克隆。如果克隆不突變，可以大量生產(chǎn)高特異性和高純度的單克隆抗體。單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)1。目的明確人可以根據(jù)自己的需要在動物體內(nèi)或體外產(chǎn)生不同類型的單克隆抗體。任何抗原、半抗原，包括各種細(xì)菌、病毒、激素、酶、氨基酸序列、核酸和其他外源蛋白或糖蛋白，都可以用于免疫動物，相應(yīng)的單克隆抗體可以通過雜交瘤技術(shù)獲得。高特異性單克隆抗體是針對特定抗

2、原或抗原上的特定決定簇制備的，與其他抗原無交叉反應(yīng)性。與其他常規(guī)免疫血清相比，單克隆抗體具有特異性高、效價(jià)高、質(zhì)地均勻等優(yōu)點(diǎn)，便于精制和濃縮。單克隆抗體的應(yīng)用可以提高檢測方法的靈敏度和特異性。同時(shí)，它可以作為純化抗原、制備疫苗、生產(chǎn)生物制劑和在基礎(chǔ)研究中使用它們的重要手段。3.生產(chǎn)簡單，易于標(biāo)準(zhǔn)化。一旦成功培育出高滴度的雜交瘤細(xì)胞系，經(jīng)鑒定合格后，可在液氮中長期保存。如果沒有突變和染色體丟失，可以長期大量生產(chǎn)高特異性和高純度的單克隆抗體。單克隆抗體制備示意圖：1。細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備；1.免疫方案選擇合適的免疫方案對細(xì)胞融合雜交的成功和獲得高質(zhì)量的單克隆抗體非常重要。一般來說，應(yīng)在融合前約兩個(gè)月建

3、立免疫程序，以開始初次免疫，免疫程序應(yīng)根據(jù)抗原的不同特性確定。可溶性抗原免疫原性弱，因此通常添加佐劑。常用的佐劑包括弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑以等體積混合在一起，研磨成油包水乳劑，并在水面上滴一滴，這很難立即擴(kuò)散，表明它已經(jīng)達(dá)到油包水的狀態(tài)。第一次免疫用Ag150g和弗氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射(一般為0.81ml0.2ml點(diǎn))與第二次免疫3周后的劑量相同，第三次免疫3周后用弗氏不完全佐劑皮下或IP(IP劑量不應(yīng)超過0.5ml)與第三次免疫3周后的劑量相同，不含佐劑，且IP(57天后，取血檢驗(yàn)其效力并檢驗(yàn)其免疫效果)在23周后加強(qiáng)免疫。合適的劑量為50，500克，注射胰島素或靜脈

4、注射3天后，應(yīng)取脾進(jìn)行融合。(2)在制備單克隆抗體的過程中，需要在許多環(huán)節(jié)添加飼養(yǎng)細(xì)胞，例如，在雜交瘤細(xì)胞的篩選、克隆和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，需要添加飼養(yǎng)細(xì)胞。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞由與免疫小鼠相同的菌株制備。BaLbc小鼠在610周齡時(shí)被殺死，浸泡在75度酒精中。消毒35分鐘后，用無菌剪刀切開皮膚。用無菌注射器注入68毫升培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗暴露的腹膜，將沖洗液吸出并放入10毫升離心管中。將1200轉(zhuǎn)的心臟懸浮在20牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中56分鐘，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)至110毫升，將其加入到96孔板中，并將100毫升孔放入37CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。通常，在融合前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞，并且可以

5、從一只小鼠獲得58106腹膜巨噬細(xì)胞。如果小鼠胸腺細(xì)胞用作飼養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞濃度為5106毫升。(3)骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)與免疫動物屬于同一品系，因此雜交融合率高，便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量單克隆抗體。常用的骨髓瘤細(xì)胞通常，骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)在準(zhǔn)備融合前兩周復(fù)蘇。為了確保細(xì)胞對HAT的敏感性，每36個(gè)月應(yīng)使用8AG(8氮雜鳥嘌呤)以防止細(xì)胞突變。細(xì)胞融合的關(guān)鍵是保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，形態(tài)良好，活細(xì)胞數(shù)大于95。在細(xì)胞融合前一天，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度設(shè)定為2105/ml，第二天通常是對數(shù)生長細(xì)胞。(4)脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞免疫是指處于免疫狀態(tài)的脾臟中的B淋巴細(xì)胞母細(xì)胞。一般來

6、說，最后一次加強(qiáng)免疫后3天取脾，制成細(xì)胞懸液。此時(shí)，B淋巴細(xì)胞比例大，融合成功率高。脾細(xì)胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全培養(yǎng)液沖洗一次，放在不銹鋼篩網(wǎng)上的平板上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。一般來說，免疫后的脾臟體積約為正常小鼠的兩倍，細(xì)胞數(shù)約為10個(gè)。(1)取對數(shù)骨髓瘤細(xì)胞SP20，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，用不完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取所需細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌兩次。(2)同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌兩次。(3)將骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞按110或15的比例混合在一起，用不完全培養(yǎng)液在50毫升塑料離心管中以1200轉(zhuǎn)/分鐘的速度洗滌一次，8分

7、鐘。(4)棄去上清液，用滴管吸取殘液，以免影響聚乙二醇的濃度。(5)輕輕彈起離心管底部，使細(xì)胞沉淀稍微松動。(6)為了在室溫下熔融，可以在30秒內(nèi)通過預(yù)熱403360加入1毫升含有5DMSO的預(yù)熱的45聚乙二醇(梅雷克，分子量4000)，并且在加入的同時(shí)攪拌混合物。持續(xù)90秒，如果冬天室內(nèi)溫度低，可以延長到120秒。加入預(yù)熱的不完全培養(yǎng)基停止聚乙二醇，每分鐘加入1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升和10毫升。(7)以800轉(zhuǎn)/分鐘離心6分鐘。(8)棄去上清液，用約6毫升20牛血清RPMI1640輕輕懸浮。記住不要用力吹氣，以免分散融合的細(xì)胞。(9)根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，加入完整的培養(yǎng)液

8、和10毫升一個(gè)96孔培養(yǎng)板。(10)將融合的細(xì)胞懸浮液加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞、100升孔、37和5CO2培養(yǎng)箱的96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)(通常，一個(gè)96孔板含有1107個(gè)脾細(xì)胞)。(11)在第3、6、9和10天，含有HAT的完整1640培養(yǎng)基被更換。注意輕吸上清液，不要吸出固定在孔底的細(xì)胞，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞。(12)在第12天和第15天，加入含有HAT的完整的1640培養(yǎng)基。雜交瘤細(xì)胞可在每次更換液體前約10天用倒置顯微鏡觀察。大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞在1020天內(nèi)出現(xiàn)，但有些只能在約1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)。雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)后，收集上清液并檢測抗體。(13)繼續(xù)生長的雜交瘤細(xì)胞的增殖和傳代。在通過過程中，HAT方

9、案和完整的1640方案被取消，取而代之的是1040方案。同時(shí)，它被儲存在液氮中并被克隆，在此期間，每一代人都應(yīng)該檢查抗體以防止抗體產(chǎn)生細(xì)胞的變異和丟失。(2) HAT選擇性雜交瘤通常融合24小時(shí)，然后加入HAT選擇性培養(yǎng)基。HT和HAT均與市售試劑50一起儲存，并將1毫升加入到50毫升20牛血清完全培養(yǎng)基中。因?yàn)轱曫B(yǎng)細(xì)胞和融合細(xì)胞已經(jīng)加入到培養(yǎng)板中，所以有200升孔。因此，在添加選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)添加3倍量的HAT。我們認(rèn)為融合后的初始補(bǔ)充量可以選擇總量的23%，可以獲得滿意的篩選結(jié)果。50 HAT h:510-3m 3360210-5mt 3360810-4m一般選擇HAT選擇性培養(yǎng)基維持培

10、養(yǎng)兩周，然后切換到HT培養(yǎng)基，再維持培養(yǎng)兩周，然后切換到普通培養(yǎng)基。(3)抗體檢測，雜交瘤細(xì)胞的篩選在通過選擇性培養(yǎng)獲得的雜交瘤細(xì)胞系中，只有少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。通常，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞被覆蓋時(shí)HAT篩選的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔中只有一個(gè)克隆。實(shí)際上，可能有幾個(gè)甚至更多的克隆。為了將這些細(xì)胞相互分離，需要克隆?？寺〉脑瓌t是盡快克隆抗體陽性的雜交克隆，否則抗體分泌細(xì)胞將被抗體分泌細(xì)胞抑制。即使是克隆的雜交瘤細(xì)胞也需要定期進(jìn)行再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞發(fā)生突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。1。有限稀釋法的程序是制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(融合前制備)陽性孔的細(xì)胞數(shù)，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)至1510毫

11、升，將130個(gè)細(xì)胞放入含飼養(yǎng)細(xì)胞的6.5毫升完整培養(yǎng)基中，即20個(gè)細(xì)胞毫升，100升孔加三排甲、乙、丙，每孔2個(gè)細(xì)胞。用含有飼養(yǎng)細(xì)胞的2.9毫升完全培養(yǎng)基補(bǔ)充剩余的2.9毫升細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為10毫升，向100毫升孔中加入三排d、e和f，每孔一個(gè)細(xì)胞。用含有飼養(yǎng)細(xì)胞的2.2毫升完全培養(yǎng)基補(bǔ)充剩余的2.2毫升細(xì)胞懸浮液，加入5毫升細(xì)胞、100升孔和兩行g(shù)和h，每孔0.5個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)45天后，在倒置顯微鏡下可以看到小細(xì)胞克隆，并加入200升完全培養(yǎng)基。第89天，肉眼可見細(xì)胞克隆，并及時(shí)進(jìn)行抗體檢測。注釋：首次克隆的雜交瘤細(xì)胞需要在完整的培養(yǎng)基中加入羥色胺。2.軟瓊脂法制備軟瓊脂RPMI1640 1

12、含20FCS(小牛血清)的瓊脂水溶液兩次濃縮：高壓滅菌，42次預(yù)熱。0.5瓊脂：加入1份1瓊脂和1份含20份小牛血清的RPMI1640制成。42歲時(shí)保持溫暖。將15毫升上述0.5瓊脂溶液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞)倒入直徑為9厘米的平板中，在室溫下固化，用作基層以備后用。根據(jù)100毫升、500毫升或5000毫升的濃度，制備待克隆的細(xì)胞懸液。室溫下，將1毫升0.5瓊脂溶液(預(yù)熱至42)與1毫升細(xì)胞懸浮液混合?；旌虾?，立即將其倒在瓊脂基質(zhì)上，在室溫下固化10分鐘，并在37，5 5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。45天后，可以看到針尖大小的白色克隆，710天后，將它們直接移植到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。檢測抗體，擴(kuò)

13、大培養(yǎng)，必要時(shí)再次克隆。(2)雜交瘤細(xì)胞的冷凍保存將雜交瘤細(xì)胞冷凍在原始孔中以及每次克隆獲得的亞克隆細(xì)胞及時(shí)冷凍是非常重要的。因?yàn)楫?dāng)沒有建立穩(wěn)定的抗體分泌細(xì)胞系時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)過程中的任何時(shí)候都可能發(fā)生細(xì)胞污染和抗體分泌能力的喪失。如果沒有原始細(xì)胞的冷凍保存，它將因上述事故而被丟棄。雜交瘤細(xì)胞的冷凍保存方法與其他細(xì)胞系相同。原則上，每個(gè)安瓿中的細(xì)胞應(yīng)超過1106個(gè)，但具有原始孔的雜交瘤細(xì)胞可因不同的培養(yǎng)環(huán)境而改變，并在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。當(dāng)每個(gè)孔的底部裝滿時(shí)，可以冷凍一個(gè)安瓿。細(xì)胞冷凍保存液： 50小牛血清40不完全培養(yǎng)液10二甲基亞砜。5.單克隆抗體的大量生產(chǎn)。大量生產(chǎn)單克隆抗體有兩種主要方法：

14、1 .在體外，雜交瘤細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管中培養(yǎng)，從上清液中獲得單克隆抗體。然而，這種方法的產(chǎn)量較低，一般培養(yǎng)基含量為1060gml。如果進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，成本很高。2.體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞制備腹水或血清。采用實(shí)體瘤法，將13107ml雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml，共24個(gè)點(diǎn)。腫瘤達(dá)到一定大小后(一般為1020天)，可采集血液，從血清中獲得的單克隆抗體含量可達(dá)1-10毫升。但是采血量是有限的。腹水的常規(guī)制備方法是腹腔注射0.5毫升石油醚或液體石蠟，12周后腹腔注射1106雜交瘤細(xì)胞。接種710天后會產(chǎn)生腹水。密切觀察動物的健康狀況和腹水的跡象，當(dāng)有盡可能多的腹水時(shí)，在小鼠死亡前將其

15、殺死，用滴管將腹水吸入試管。通常腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20毫克/毫升，是目前最常用的方法。腹水中的細(xì)胞也可以冷凍。復(fù)蘇后，移植小鼠腹腔內(nèi)可迅速大量產(chǎn)生腹水。6.單克隆抗體的鑒定有必要對制備的單克隆抗體進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定。應(yīng)確定以下方面： 1。抗體特異性的鑒定：除了用免疫原(抗原)檢測抗體外，還應(yīng)使用與其抗原成分相關(guān)的其他抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，并可使用酶聯(lián)免疫吸附法和IFA法。例如，為了制備抗黑色素瘤細(xì)胞的單克隆抗體，除了與黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)之外，其它器官的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞也用于交叉反應(yīng)，從而選擇抗腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。制備抗重組細(xì)胞因子的單克隆抗體，首先要考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，然后再考慮是否與其他細(xì)胞因子發(fā)生交叉反應(yīng)。2.免疫球蛋白類和2亞類的鑒定。單克隆抗體：一般來說，當(dāng)用酶標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的二級抗體進(jìn)行篩選時(shí)，抗體的免疫球蛋白類型已經(jīng)基本確定。如果使用酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，檢測到的抗體通常是IgG或IgM。對于亞類，有必要使用標(biāo)準(zhǔn)的抗亞類血清系統(tǒng)進(jìn)行雙擴(kuò)增或夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)來確定單克隆抗體的亞類。在雙膨脹