1、專題2 細(xì)胞工程 動物細(xì)胞融合與單克隆抗體,知識目標(biāo) 1.了解動物細(xì)胞融合的概念、過程、意義。 2.說出植物體細(xì)胞雜交與動物細(xì)胞融合的異同。 3.掌握單克隆抗體的制備過程及應(yīng)用 。,2002年12月30日， 兩場籌備了10年的“太空婚禮”首次在神舟四號飛船上舉行，植物細(xì)胞“新人”黃花煙草和革新一號煙草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體，動物細(xì)胞“新人”是小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，兩批新人同時在 “產(chǎn)房”電融合儀內(nèi)孕育新生命。,“太空婚禮”,這兩場“太空婚禮”實質(zhì)是哪兩項細(xì)胞工程技術(shù),？,植物體細(xì)胞雜交技術(shù),動物細(xì)胞融合技術(shù),教學(xué)目標(biāo)1,植物體細(xì)胞雜交過程：,融合的原生質(zhì)體,雜種細(xì)胞,細(xì)胞分裂（脫分化）,分化發(fā)

2、育（再分化）,愈傷組織,雜種植株,原生質(zhì)體的制備,原生質(zhì)體的融合,篩選,植物細(xì)胞的融合,植物組織培養(yǎng),思考：,1、如果讓動物細(xì)胞進(jìn)行融合/雜交，應(yīng)注意動、植物之間的哪些區(qū)別？,無細(xì)胞壁 全能性受限制，不能發(fā)育成雜種動物,動物細(xì)胞融合與植物細(xì)胞雜交的不同： 無需去除細(xì)胞壁 不能培養(yǎng)成新的動物個體,(一)概念,動物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交,是指兩個或多 個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的過程。,（二）動物細(xì)胞融合的過程,與植物原生質(zhì)體融合原理相同，方法類似。,雜交細(xì)胞:融合后形成的具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞。,一、動物細(xì)胞融合,細(xì)胞膜的流動性,滅活病毒、PEG、電激等,融合后的細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂

3、，形成完整的雜交細(xì)胞,誘導(dǎo)的手段：,融合后細(xì)胞的類型：,AB雜種細(xì)胞遺傳物質(zhì) 有什么特點？,三種AA、AB、BB（A、B）,含兩種生物的遺傳物質(zhì),1.2動物細(xì)胞融合過程,原理：,融合完成的標(biāo)志：,1.2動物細(xì)胞融合過程,為什么滅活的病毒能作誘導(dǎo)劑？不滅活行嗎？,滅活喪失感染性,不滅活的話會感染細(xì)胞， 而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。,不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)，保留融合活性,二.動物細(xì)胞融合,教學(xué)目標(biāo)1,意義：,突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。 這一項技術(shù)成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。,應(yīng)用：,最重要的用途是：制備單克隆抗體,小

4、結(jié)：一、動物細(xì)胞融合（細(xì)胞雜交）,1.概念：,指兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的過程。,2.結(jié)果：,形成含有2或多個細(xì)胞遺傳物質(zhì)的單核雜交細(xì)胞,3.融合原理：,細(xì)胞膜的流動性,4.誘導(dǎo)方式,物理法：離心、振動、電激,化學(xué)法：聚乙二醇（PEG),生物法：滅活的病毒,5.意義：,突破有性雜交局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能 廣泛應(yīng)用多個領(lǐng)域 重要用途：制備單克隆抗體,植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合的比較,獲得雜種植株,細(xì)胞膜的流動性,細(xì)胞膜的流動性 細(xì)胞的全能性,去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合,使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合,物理（離心、振蕩、電刺激） 化學(xué)（聚乙二醇）,物理、化學(xué)方法（同左） 滅活的病毒,制備

5、單克隆抗體,【例1】能使動物細(xì)胞融合的特有的誘導(dǎo)因子是 （ ） A.離心 B.滅活的病毒 C.電刺激 D.振動 【例2】融合后的雜交細(xì)胞的遺傳物質(zhì)有何特點（ ） 具有原來兩個或多個細(xì)胞的遺傳信息 B.能無限增殖 C.可形成新個體 D.培養(yǎng)過程會貼壁 【例3】動物細(xì)胞融合的作用中最重要的是（ ） A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和 B.制備單克隆抗體 C.培育新物種 D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞,B,B,初試牛刀,A,材料1: 1970年，有兩位科學(xué)家做了一個人鼠細(xì)胞融合的實驗，以證明細(xì)胞膜的流動性。那么，如何實現(xiàn)人鼠細(xì)胞的融合，動物細(xì)胞融合后還有什么用途呢？,人-鼠(想像圖),強(qiáng)調(diào)：效應(yīng)B淋巴細(xì)胞是能夠產(chǎn)生抗體的B淋

6、巴細(xì)胞，下文將其簡稱為B淋巴細(xì)胞,抗體：能夠與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。 能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞是漿細(xì)胞（即效應(yīng)B細(xì)胞）。,溫故知新,二、單克隆抗體,B淋巴細(xì)胞,效應(yīng)B淋巴細(xì)胞(漿細(xì)胞),記憶B淋巴細(xì)胞,分化,自主閱讀P52：傳統(tǒng)的抗體的生產(chǎn)方法及 缺陷是什么？,抗原,反復(fù)注射動物,從動物的血清中分離抗體,該法制備抗體的缺點： 產(chǎn)量低、純度低，且抗體的特異性差、靈敏度低。,讀下面一段資料，找出單克隆抗體的概念,人們發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)生免疫反應(yīng)的過程中，體內(nèi)的B細(xì)胞可以產(chǎn)生多達(dá)百萬種以上的特異性抗體，但是每個B細(xì)胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用單個B細(xì)胞進(jìn)行培

7、養(yǎng)形成細(xì)胞群，即克隆。,2.1單克隆抗體的概念,用單個B淋巴細(xì)胞進(jìn)行（無性繁殖）克隆，得到的基因型相同的細(xì)胞群能夠分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體，這種抗體就叫做單克隆抗體。,思考：,科學(xué)家的設(shè)想：克隆（無性繁殖）單一的B淋巴細(xì)胞，形成細(xì)胞群，產(chǎn)生大量高純度抗體。,存在的困難：,體外培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞不可無限增殖,問題1：哪種細(xì)胞可以無限增殖呢？,骨髓瘤細(xì)胞,問題2：怎樣讓細(xì)胞既能大量繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體呢？,B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,制備單克隆抗體,怎樣獲得大量高純度抗體呢？,為什么給小鼠注射特定的抗原蛋白？ 會有幾種融合方式？ 雜交瘤細(xì)胞是如何篩選出來的？有何特點？ 是否所有

8、的雜交瘤細(xì)胞都能產(chǎn)生專一性抗體？ 如何大規(guī)模進(jìn)行培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體？,單克隆抗體制備過程,BB 、B瘤 、瘤瘤 （B、瘤）,（一選）選擇性培養(yǎng)基：只有雜交瘤細(xì)胞才能存活,獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B細(xì)胞,（二選）：選能產(chǎn)生所需專一抗體的雜交瘤細(xì)胞(多孔培養(yǎng)板),體外培養(yǎng),小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng),雜交瘤細(xì)胞特點：既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量增殖。,如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？,融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然

9、后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行34次，直至確信每個孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。,單克隆抗體的制備,教學(xué)目標(biāo)2,思考問題：,1、本過程利用了哪些原理？,免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理,2、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？,這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體,?,2.3單克隆抗體的應(yīng)用,診斷試劑最廣

10、泛應(yīng)用 準(zhǔn)確、高效、簡易、快速,單克隆抗體最主要的優(yōu)點：特異性強(qiáng)，靈敏度高，并能大量制備。,（如同位素標(biāo)記單克隆抗體，可診斷腫瘤、心血管畸形等）,（2）治療疾病： 運載藥物：,生物導(dǎo)彈 = 單克隆抗體 + 藥物，治療腫瘤,(“生物導(dǎo)彈” 單抗制導(dǎo)瞄準(zhǔn)，藥物為彈藥),主要用于癌癥治療,瞄準(zhǔn)癌細(xì)胞的生物導(dǎo)彈,優(yōu)勢：既不損傷正常細(xì)胞，又減少了用藥劑量。,單克隆抗體制備過程,專一抗體檢驗陽性,【例1】能使動物細(xì)胞融合的特有的誘導(dǎo)因子是 （ ） A.離心 B.滅活的病毒 C.電刺激 D.振動 【例2】融合后的雜交細(xì)胞的遺傳物質(zhì)有何特點（ ） 具有原來兩個或多個細(xì)胞的遺傳信息 B.能無限增殖 C.可形成新

11、個體 D.培養(yǎng)過程會貼壁 【例3】動物細(xì)胞融合的作用中最重要的是（ ） A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和 B.制備單克隆抗體 C.培育新物種 D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞,B,B,初試牛刀,A,【例4】科學(xué)家用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與某種細(xì)胞融合，得到雜交細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，與骨髓瘤細(xì)胞融合的是（ ） A.經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞 C.經(jīng)過免疫的T淋巴細(xì)胞 B.不經(jīng)過免疫的T淋巴細(xì)胞 D.不經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞 【例5】單克隆抗體是由下列哪種細(xì)胞產(chǎn)生的 （ ） B淋巴細(xì)胞 BT淋巴細(xì)胞 C骨髓瘤細(xì)胞 D雜交瘤細(xì)胞,A,初試牛刀,D,【例6】用動物細(xì)胞工程技術(shù)獲取單克隆抗體，下列實驗步驟中錯誤的是（ ） A將抗原注入小鼠體內(nèi)，獲得能產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞 B用纖維素酶處理B淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞 C用聚乙二醇作誘導(dǎo)劑，促使能產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合 D篩選雜交細(xì)胞，并從中選出能產(chǎn)生所需抗體的細(xì)胞群，培養(yǎng)后提取單克隆抗體,B,初試牛刀,7.下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌的實驗方案,制備單克隆抗體,不能，沒有注射抗原，無法獲得產(chǎn)生單一抗體的B淋巴細(xì)胞。,(1)該實驗方案的目的是：,(2)該方案能達(dá)到預(yù)期效果嗎？為什么？,(3)A是從小鼠的脾臟中取得_ 該細(xì)胞能夠產(chǎn)生_ 。,(4).圖中B為_過程，常用_誘導(dǎo)，該細(xì)