1、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力的測定（賴氏法）,第八組,【實驗?zāi)康摹?了解血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力單位的定義 掌握血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力單位的測定方法和臨床意義,【實驗原理】,丙酮酸-2,4-二硝基苯腙在堿性環(huán)境中呈現(xiàn)紅棕色，顏色的深淺與丙酮酸含量成正比，與標準丙酮酸的顯色進行比較，求出樣品中ALT的活性,（紅棕色，=505nm),【試劑】,10.1mol/L磷酸二氫鉀溶液 稱取KH2PO4 13.61g，溶解于蒸餾水中，加水至1 000ml，4保存。 20.1mol/L磷酸氫二鈉溶液 稱取Na2HPO414.22g，溶解于蒸餾水中，并稀釋至1 000ml，4保存。 30.1mol/L磷酸鹽緩沖液

2、（pH7.4） 取420ml 0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液和80ml 0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液，混勻，即為pH7.4的磷酸鹽緩沖液。加氯仿數(shù)滴，4保存 4基質(zhì)緩沖液 精確稱取D-L-丙氨酸1.79g，-酮戊二酸29.2mg，先溶于0.1mol/L磷酸鹽緩沖液約50ml中，用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，再加磷酸鹽緩沖液至100ml，46保存，該溶液可穩(wěn)定2w。每升底物緩沖液中可加入麝香草酚0.9g或加氯仿防腐，4保存。配成200mmol/L丙氨酸與2.0mmol/L-酮戊二酸基質(zhì)緩沖液。,【試劑】,51.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液 稱取2，4-二硝基苯肼（AR）19

3、.8mg，溶于1.0mol/L鹽酸100ml，置棕色玻璃瓶中，室溫中保存，若冰箱保存可穩(wěn)定2個月。若有結(jié)晶析出，應(yīng)重新配制。 60.4mol/L NaOH溶液 稱取NaOH 1.6g溶解于蒸餾水中，并加蒸餾水至100ml，置具塞塑料試劑瓶內(nèi)，室溫中可長期穩(wěn)定。 72.0mmol/L丙酮酸標準液 準確稱取丙酮酸鈉（AR）22.0mg，置于100ml容量瓶中，加0.05mol/L硫酸至刻度。此液不穩(wěn)定，應(yīng)臨用前配制。丙酮酸不穩(wěn)定，開封后易變質(zhì)（聚合），相互聚合為多聚丙酮酸，需干燥后使用。 8待測標本 病人血清或質(zhì)控血清。,【操作步驟】,1 . 標準曲線的繪制：取試管5支，按表操作。,【操作步驟】,

4、（2）混勻，放置5min，在波長505nm處，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度，各管吸光度均減“1”號管吸光度為該標準管的吸光度值。 （3）以吸光度值為縱坐標，對應(yīng)的酶卡門氏活性單位為橫坐標，各標準管代表的活性單位與吸光度值作圖，即成校正曲線。,(An-A0) 卡門氏單位 0 28 57 97 150,標準曲線的繪制,【操作步驟】,2標本的測定 （1）在測定前取適量的底物溶液和待測血清，37水浴預(yù)溫5min后使用；具體操作按下表進行。,血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力的測定,混勻，室溫放置5min后，在505nm波長處以蒸餾水調(diào)零比色，讀取吸光度。,【計算】 測定管吸光度減去樣本對照管吸光度的差值為標本的

5、吸光度。該值在校正曲線上查得ALT的卡門氏單位 【參考范圍】 血清ALT：525卡門氏單位,臨床意義,ALT在肝細胞中含量較多，且主要存在于肝細胞的可溶性部分。當肝臟受損時，此酶可釋放入血，致血中該酶活性濃度增加，故測定ALT常作為判斷肝臟受損指標。 1肝細胞損傷的靈敏指標 急性病毒性肝炎轉(zhuǎn)氨酶陽性率為80%100%，肝炎恢復(fù)期，轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)入正常，但如在100U左右波動或再度上升為慢性活動性肝炎；重癥肝炎或亞急性肝壞死時，再度上升的轉(zhuǎn)氨酶在癥狀惡化的同時，酶活性反而降低，是肝細胞壞死后增生不良，預(yù)后不佳。以上說明，監(jiān)測轉(zhuǎn)氨酶可以觀察病情的發(fā)展，并作預(yù)后判斷。,臨床意義,2慢性活動性肝炎或脂肪肝轉(zhuǎn)

6、氨酶輕度增高（100200U），或?qū)僬７秶褹STALT。肝硬化、肝癌時，ALT有輕度或中度增高，提示可能并發(fā)肝細胞壞死，預(yù)后嚴重。其它原因引起的肝臟損害，如心功能不全時，肝淤血導(dǎo)致肝小葉中央帶細胞的萎縮或壞死，可使ALT、AST明顯升高；某些化學(xué)藥物如異菸肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷劑等可不同程度地損害肝細胞，引起ALT的升高。 3其他疾病或因素亦會引起ALT不同程度的增高，如骨路肌損傷、多發(fā)性肌炎等。,【注意事項】,1丙酮酸標準液的配制 丙酮酸不穩(wěn)定，見空氣易發(fā)生聚合反應(yīng)，生成多聚丙酮酸，而失去其化學(xué)性質(zhì)。在配制校正曲線時，不會出現(xiàn)顯色反應(yīng)。此時應(yīng)將變性的丙酮酸放在干燥箱（405

7、5）23h，或干燥器中過夜后再使用。 2基質(zhì)液中的-酮戊二酸和顯色劑2，4-二硝基苯肼均為呈色物質(zhì)，稱量必須很準確，每批試劑的空白管吸光度上下波動不應(yīng)超過0.015A，如超出此范圍，應(yīng)檢查試劑及儀器等方面問題。 3血清中ALT在室溫（25）可以保存2d，在4冰箱可保存1w，在25可保存1個月。一般血清標本中內(nèi)源性酮酸含量很少，血清對照管吸光度接近于試劑空白管（以蒸餾水代替血清，其它和對照管同樣操作）。所以，成批標本測定時，一般不需要每份標本都作自身血清對照管，以試劑空白管代替即可，但對超過正常值的血清標本應(yīng)進行復(fù)查。嚴重脂血、黃疸及溶血血清可引起測定的吸光度增高；糖尿病酮癥酸中毒病人血中因含有

8、大量酮體，能和2，4-二硝基苯肼作用呈色，也會引起測定管吸光度增加。因此，檢測此類標本時，應(yīng)作血清標本對照管。,【注意事項】,4賴氏法考慮到底物濃度不足，酶作用產(chǎn)生的丙酮酸的量不能與酶活性成正比，故沒有制定自身的單位定義，而是以實驗數(shù)據(jù)套用速率法的卡門氏單位。賴氏法校正曲線所定的單位是用比色法的實驗結(jié)果和卡門分光光度法實驗結(jié)果作對比后求得的，以卡門氏單位報告結(jié)果。卡門法是早期的酶偶聯(lián)速率測定法，卡門氏單位是分光光度單位。定義為血清1ml，反應(yīng)液總體積3ml，反應(yīng)溫度25，波長340nm，比色杯光徑1.0cm，每min吸光度下降0.001A為一個卡門氏單位（相當于0.48U）。賴氏法的測定溫度原

9、為40，校正曲線只到97個卡門氏單位，后來改用37測定將校正曲線延長至150卡門氏單位。賴氏比色法測定由于受底物-酮戊二酸濃度和2，4-二硝基苯肼濃度的不足以及反應(yīng)產(chǎn)物丙酮酸的反饋抑制等因素影響，校正曲線不能延長至200卡門氏單位。當血清標本酶活力超過150卡門氏單位時，應(yīng)將血清用0.145mol/L NaCl溶液稀釋后重測，其結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。 5加入2，4-二硝基苯肼溶液后，應(yīng)充分混勻，使反應(yīng)完全。加入NaOH溶液的方法和速度要一致，如液體混合不完全或NaOH溶液的加入速度不同均會導(dǎo)致吸光度讀數(shù)的差異。呈色的深淺與NaOH的濃度也有關(guān)系，NaOH濃度越大呈色越深。NaOH溶液0.25mol

10、/L時，吸光度下降變陡，因此NaOH濃度要準確。,連續(xù)監(jiān)測法測定AST,【實驗原理】,【試劑】,試劑 Tris緩沖液 80mmol/L L-門冬氨酸 240mmol/L NADH 0.18mmol/L 蘋果酸脫氫酶（MDH） 420U/L 乳酸脫氫酶（LDH） 600U/L pH 7.8 試劑 12mmol/L a-酮戊二酸,【操作步驟】,1 取血清100ul，加試劑1000ul，混勻，37溫育5min。 2 加入試劑100ul，在混勻，啟動AST催化反應(yīng)。 3 在波長340nm，比色杯1.0cm，延遲期30s，連續(xù)監(jiān)測吸光度下降速率約60s，求出線性反應(yīng)期吸光度下降速率。,【計算】 AST（U/L） =A/min106/62201.1/0.1 = A/min1768 式中6220為NADH在340nm的摩爾吸光度。 【參考范圍】 成人540U/L,【注意事項】,1.使用連續(xù)監(jiān)測法測定酶的活性時