1、RNA干擾技術基本原理與應用,什么是RNA干擾,RNA干擾(RNA interference，RNAi),又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指將特異性同源雙鏈RNA(dsRNA)導入到細胞內(nèi)，使目的基因的不表達或表達水平下降.,2001、2002年連續(xù)被Science評為年度十大成就!,目前應用的基因干擾技術,DNA水平的基因干擾技術 基因敲除技術 寡核苷酸與雙鏈DNA 雜交 采用多胺等小分子識別并阻遏特定轉(zhuǎn)錄因子,目前應用的基因干擾技術,mRNA水平的基因干擾技術 用反義RNA 技術阻遏翻譯過程, 破壞內(nèi)源性mRNA 設

2、計寡核苷酸來破壞與mRNA 結(jié)合的蛋白質(zhì), 使mRNA 不穩(wěn)定 雙鏈RNA 干擾技術（RNAi）,RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程,1984 年,Jonathan 研究小鼠L 細胞時發(fā)現(xiàn)反義mRNA 會干擾同源基因的表達，機制不清 1990年 Jorgensen等 矮牽牛顏色加深實驗 “共抑制(co-suppresion)”,RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程,1995年 Su Guo 和Ken Emphues 反義RNA阻斷秀麗小桿線蟲par-1基因的表達 實驗 首次發(fā)現(xiàn) RNA干擾現(xiàn)象 1998年 Andrew Fire和Craig Mello 發(fā)現(xiàn)單鏈RNA抑制作用較弱，而純化的dsRNA可高效、特異地抑

3、制基因的表達 Nature1998； 391: 806-11 正式提出RNA干擾的概念,RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程,1999年 Tuschl等 報道在哺乳動物中也存在RNAi 2001 年 Berstein 等 提出只有22 核苷酸dsRNA才有特異性的阻斷效應，并發(fā)現(xiàn)體內(nèi)分解dsRNA 為siRNAs (short/small interfering RNA) 的DICER 酶,RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程,2002 年 Novina 等 用RNAi 技術實現(xiàn)了對HIV-1 病毒的阻抑 2004年 Morris 等 用RNAi技術實現(xiàn)了對人細胞基因的抑制 Science 2004(August 2

4、7)；305：1289-1292,RNAi的主要特點和優(yōu)勢,誘導轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 具有高度的特異性 抑制基因表達的效率非常高 可在不同細胞之間傳遞甚至傳到子代中去 “基因沉默系統(tǒng)化”,siRNA 與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶,共同點 特異性 靶向性,siRNA 與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶,不同點 獨特的雙鏈結(jié)構(gòu) 需要Dicer、RdRp 、解旋酶、激酶等協(xié)同因子 siRNA 本身無催化活性 在細胞內(nèi)可能具有相對的穩(wěn)定性 具有一定的可遺傳性,RNAi的主要過程,啟動階段 dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特異性識別，以一種ATP依賴的方式逐步切割成siRNA 長度：21

5、-25nt 結(jié)構(gòu)：3端懸垂兩個未配對的堿基UU,細胞中內(nèi)源性dsRNA的形成,基因組中DNA 反向重復序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 同時轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA 病毒RNA 復制中間體 以單鏈RNA 為模板由細胞或病毒的RNA 依賴RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA,Dicer酶,RNAase III超家族成員。結(jié)構(gòu)中包括一個螺旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個RNA酶結(jié)構(gòu)域，一個雙鏈RNA結(jié)合位點 對單鏈RNA沒有活性 對200500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA 廣泛存在,RdRp（RNA dependent RNA polymerase）,使異常的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sRNA 參與細胞

6、內(nèi)dsRNA和siRNA的擴增 siRNA與靶mRNA 的結(jié)合可激活RdRp，形成大量的dsRNA,RNAi的主要過程,效應階段 RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC） 的形成 siRNA、核酸內(nèi)切酶、外切酶和解旋酶 RISC的激活：ATP依賴的解雙鏈過程 在siRNA反義鏈的指導下，RISC特異性切 割、降解靶mRNA，導致基因表達失活,RNAi技術的實驗方法,siRNA的設計原則 序列大小 19-21nt ，最好以A或G開始 從mRNA的AUG開始，尋找AA二連序列，作為潛在的RNAi靶位點 不要針對5和3端非編碼區(qū)（untransla

7、ted regions，UTRs),RNAi技術的實驗方法,siRNA的設計原則 設計24個序列, BLAST 比對基因序列以確保序列設計的特異性 優(yōu)先選擇 GC 含量30-50%的序列 設計適當?shù)年幮詫φ招蛄?陰性對照序列的設計,特異性siRNA中的堿基進行隨機排列，且行BLAST基因比對 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG 在特異性siRNA引入12個錯配堿基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG,目標序列篩選的相關網(wǎng)站,查找已經(jīng)證實的siRNA的網(wǎng)站,siRNA的制備方法,體外制備方法 化學合成

8、siRNA 體外轉(zhuǎn)錄獲取siRNA 利用Dicer或 RNase消化長的dsRNA成siRNA,化學合成法制備siRNA,優(yōu)點： 純度高 合成量不受限 能被標記 缺點：價格昂貴、合成周期長 用途：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下， 需要大量siRNA進行研究,體外轉(zhuǎn)錄法制備siRNA,優(yōu)點：簡單 成本低 速度快 毒性小 穩(wěn)定性好 缺點：反應規(guī)模和量始終有一定的限制 用途：篩選siRNAs，特別是需要制備多種 siRNAs,消化法（ “ siRNAs 雞尾酒 ”）,優(yōu)點：無需檢測或篩選多個siRNA序列 產(chǎn)生多種 siRNAs 混合體，保證有效的 目的基因沉默 缺點：有可能引發(fā)非特異的基因沉默

9、 用途：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失 的表型,siRNA的制備方法,細胞內(nèi)制備方法 依賴表達質(zhì)粒或病毒載體在細胞內(nèi)獲取siRNA 通過PCR介導的siRNA表達試劑盒獲取siRNA,siRNA載體,依賴RNA聚合酶III 啟動子(pol III) ，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動物細胞中的表達。 人源U6啟動子 鼠源的U6啟動子 人H1啟動子 pol III可在細胞中表達許多的小分子RNA，通過添加一串（36個）U來終止轉(zhuǎn)錄的 需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈再克隆到載體中,表達載體法制備siRNA,優(yōu)點：可以進行較長期研究。載體可以在細胞中 持續(xù)抑制靶基因達數(shù)星期或更久

10、缺點：需要進行克隆，周期長 質(zhì)粒載體表達效率較低 用途：唯一可以用于長期基因沉寂研究的方法,基于PCR的siRNA表達框架(SECs),組成：RNA pol III啟動子 發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA RNA pol III終止位點 制備：PCR ，無需克隆和測序,用SECs制備siRNA,優(yōu)點： 可直接由PCR得到，方法簡便，時間短 在PCR片段兩端添加酶切位點，篩選出 最有效的siRNA可用于構(gòu)建表達載體 可以用來篩選特定研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配,用表達框架制備siRNA,缺點： PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中 不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能產(chǎn)生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導致結(jié)果不理想

11、用途： 篩選siRNA序列 在將siRNA克隆到載體前篩選最佳啟動子,shRNA(short hairpin RNA) 文庫,Nature 2004 ；428： 427 - 431 (25 March) 針對：9,610 human genes 5,563 mouse genes 構(gòu)建成：28,000個shRNA表達盒(cassettes) 商品化試劑盒：Expression Arrest (美國冷泉港實驗室 Open Biosystems公司) 網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫中選擇特定的shRNA克隆，無需再耗時耗力進行siRNA的設計、合成和驗證過程,CAM:氯霉素抗性基因 hr：同源重組位點 Barcode

12、：每個shRNA獨特的識別序列 MSCV：病毒載體骨架 PKG-Puro：哺乳動物細胞中載體穩(wěn)定性的選擇 Kan、oriT、RK6：逆轉(zhuǎn)錄病毒信號序列,siRNA轉(zhuǎn)染細胞,.磷酸鈣共沉淀 電穿孔法 DEAE-葡聚糖和polybrene 機械法 ：顯微注射和基因槍 陽離子脂質(zhì)體試劑,提高轉(zhuǎn)染效率的方法,純化的siRNA 避免使用抗生素 避免RNA酶污染 較低傳代數(shù)的細胞 合適的轉(zhuǎn)染試劑 合適的陽性對照 熒光標記的siRNA,RNAi技術的應用,基因組功能研究的新方法 研究信號傳導通路的新途徑 開展基因治療的新策略 （抗病毒、抗腫瘤等） 篩選藥物靶點的新工具,RNAi技術抗病毒,作用 阻止病毒入侵、抑制病毒的復制和轉(zhuǎn)錄 自然界中普遍存在 在醫(yī)學上的應用 RNA病毒：如HIV、HCV、脊髓灰質(zhì)炎病毒 DNA病毒：如HBV,RNAi技術阻止HIV的入侵,Novina將針對CD4的dsRNA導入 能表達CD4、CCR 5、CXCR4的M agi2CCR 5 細胞系），能使細胞表面CD4 表達減少75%；轉(zhuǎn)染后60 小時后, 再用H IV 感染, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4-siRNA 轉(zhuǎn)染的細胞很少有包涵體出現(xiàn) 其它試驗的受體： CCR 5、CXCR4,RNAi技術抑制HIV的復制,將HIV-1編碼rev的基因和