中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

犌犅１５１９３．６—２０１４

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

２０１５０１２８發(fā)布２０１５０５０１實(shí)施

中華人民共和國(guó)

國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

發(fā)布

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Ⅰ

前言

本標(biāo)準(zhǔn)代替ＧＢ１５１９３．６—２００３《哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)》。

本標(biāo)準(zhǔn)與ＧＢ１５１９３．６—２００３相比，主要變化如下：

———標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)”；

———修改了范圍；

———增加了術(shù)語(yǔ)和定義；

———修改了試驗(yàn)?zāi)康暮驮恚?/p>

———修改了試驗(yàn)方法；

———修改了數(shù)據(jù)處理。

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食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

１范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)的基本試驗(yàn)方法和技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于評(píng)價(jià)受試物對(duì)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞的遺傳毒性。

２術(shù)語(yǔ)和定義

２．１染色體結(jié)構(gòu)畸變

通過顯微鏡可以直接觀察到的發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂中期的染色體結(jié)構(gòu)變化。如染色體中間缺失和

斷片，染色體互換和內(nèi)交換等。結(jié)構(gòu)畸變可分為染色體型畸變（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｔｙｐｅａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）和染色單

體型畸變（ｃｈｒｏｍａｔｉｄｔｙｐｅａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）。

２．２染色體型畸變

染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為在兩個(gè)染色單體的相同位點(diǎn)均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組的改變。

２．３染色單體型畸變

染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。

２．４染色體數(shù)目畸變

染色體數(shù)目發(fā)生改變，不同于正常核型。

２．５核內(nèi)復(fù)制

在ＤＮＡ復(fù)制的Ｓ期之后，細(xì)胞核未進(jìn)行有絲分裂就開始了另一個(gè)Ｓ期的過程。其結(jié)果是染色體

有４、８、１６…倍的染色單體。

２．６裂隙

染色體或染色單體損傷的長(zhǎng)度小于一個(gè)染色單體的寬度，為染色單體的最小錯(cuò)誤排列。

２．７有絲分裂指數(shù)

中期相細(xì)胞數(shù)與所觀察的細(xì)胞總數(shù)之比值。

３試驗(yàn)?zāi)康暮驮?/p>

在試驗(yàn)動(dòng)物給予受試物后，用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙胺）處理，抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡

錘體的形成，以便增加中期分裂相細(xì)胞的比例，隨后取材、制片、染色、分析染色體畸變。

本試驗(yàn)可檢測(cè)受試物能否引起整體動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變，以評(píng)價(jià)受試物致突變的可能性。若

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有證據(jù)表明受試物或其代謝產(chǎn)物不能到達(dá)骨髓，則不適用于本方法。

４儀器和試劑

４．１儀器

實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備、恒溫水浴鍋（３７℃±５℃）、離心機(jī)、生物顯微鏡。

４．２試劑

４．２．１秋水仙素（０．４ｍｇ／ｍＬ）：置于棕色瓶中，

冰箱保存。

４．２．２氯化鉀溶液（０．０７５ｍｏｌ

／Ｌ）。

４．２．３固定液：甲醇與冰醋酸以３∶１混合，

臨用時(shí)現(xiàn)配。

４．２．４姬姆薩（Ｇｉｅｍｓａ）儲(chǔ)備染液：?。牵椋澹恚螅崛玖希常福绾蜕倭考状加谌槔徖镒屑?xì)研磨，

逐漸加入甲醇

至３７５ｍＬ，待完全溶解后，再加入１２５ｍＬ甘油，混合均勻。置３７℃恒溫箱中保溫４８ｈ。保溫期間振

搖數(shù)次，促使染料的充分溶解。取出過濾，室溫保存，兩周后使用。

４．２．５Ｇｉｅｍｓａ應(yīng)用染液：?。狈荩牵椋澹恚螅醿?chǔ)備染液與９份磷酸鹽緩沖液（１／１５ｍｏｌ／Ｌ）混合而成。臨用

時(shí)配制。

４．２．６磷酸鹽緩沖液（

ｐＨ６．８）。

４．２．６．１磷酸氫二鈉溶液（１／１５ｍｏｌ

／Ｌ）：磷酸氫二鈉（Ｎａ２ＨＰＯ４）９．４７ｇ溶于１０００ｍＬ去離子水中。

４．２．６．２磷酸二氫鉀溶液（１／１５ｍｏｌ

／Ｌ）：磷酸二氫鉀（ＫＨ２ＰＯ４）９．０７ｇ溶于１０００ｍＬ去離子水中。

４．２．６．３取磷酸氫二鈉溶液（１／１５ｍｏｌ

／Ｌ）５０ｍＬ與磷酸二氫鉀溶液（１／１５ｍｏｌ／Ｌ）５０ｍＬ混合。

４．２．７陽(yáng)性對(duì)照物：常用環(huán)磷酰胺，絲裂霉素Ｃ等。

５試驗(yàn)方法

５．１受試物

受試物應(yīng)使用原始樣品，若不能使用原始樣品，應(yīng)按照受試物處理原則對(duì)受試物進(jìn)行適當(dāng)處理。

５．２實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

５．２．１動(dòng)物選擇

常用健康年輕的成年大鼠或小鼠，如使用小鼠，可選擇７周齡～１２周齡，試驗(yàn)開始時(shí)動(dòng)物體重的差

異不應(yīng)超過平均體重的２０％。動(dòng)物應(yīng)隨機(jī)分組，每組雌性和雄性動(dòng)物至少各５只。如果試驗(yàn)設(shè)有幾個(gè)

采樣時(shí)間點(diǎn)，則要求每組每個(gè)性別每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)都有５只能用于分析的動(dòng)物。

５．２．２動(dòng)物準(zhǔn)備

試驗(yàn)前動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房至少應(yīng)進(jìn)行３ｄ～５ｄ環(huán)境適應(yīng)和檢疫觀察。

５．２．３動(dòng)物飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件應(yīng)符合ＧＢ１４９２５、飲用水應(yīng)符合ＧＢ５７４９、飼料應(yīng)符合ＧＢ１４９２４的有關(guān)規(guī)定。

試驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水和攝食，每籠動(dòng)物數(shù)應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最低需要的空間，以不影響動(dòng)物自由活動(dòng)和

觀察動(dòng)物的體征為宜。

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３

５．３劑量

應(yīng)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以選擇最高劑量。如果受試物具有毒性，應(yīng)設(shè)３個(gè)劑量，最高劑量組原則上為動(dòng)物出

現(xiàn)嚴(yán)重中毒表現(xiàn)和（或）個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)死亡的劑量，一般可?。保玻蹋模担埃蛣┝拷M應(yīng)不表現(xiàn)出毒性，分別

取１／４ＬＤ５０和１／８ＬＤ５０作為中、低劑量。對(duì)于在低或無毒劑量下具有特異生物學(xué)活性的物質(zhì)（如激素

和絲裂源）可以抑制骨髓細(xì)胞有絲分裂指數(shù)（５０％以上）為指標(biāo)確定最高劑量，按等比級(jí)數(shù)２向下設(shè)置

中、低劑量組。急性毒性試驗(yàn)給予受試物最大劑量（最大使用濃度和最大灌胃容量）動(dòng)物無死亡而求不

出ＬＤ５０，并且根據(jù)結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)資料不能推斷受試物具有遺傳毒性時(shí)，則不必設(shè)３個(gè)劑量。按以下順

序只設(shè)一個(gè)劑量：

ａ）１０ｇ／

ｋｇ

體重；

ｂ）人的可能攝入量的１００倍；

ｃ）一次最大灌胃劑量，連續(xù)染毒１４ｄ。另設(shè)溶媒對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，如果沒有文獻(xiàn)資料或歷史

性資料證實(shí)所用溶媒不具有有害作用或致突變作用，還應(yīng)設(shè)空白對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照物可用絲

裂霉素Ｃ（１．５ｍｇ／

ｋｇ

體重～２．０ｍｇ／

ｋｇ

體重）或環(huán)磷酰胺（４０ｍｇ／

ｋｇ

體重）經(jīng)口或腹腔注射

給予。

５．４試驗(yàn)步驟

５．４．１給予受試物方式

經(jīng)口給予受試物，受試物溶液一次灌胃量不應(yīng)超過２０ｍＬ／

ｋｇ

體重。采用一次染毒或多次染毒方

式。一次染毒應(yīng)分兩次采集標(biāo)本，即每組動(dòng)物分兩個(gè)亞組，亞組１于染毒后１２ｈ～１８ｈ處死動(dòng)物采集

第一次標(biāo)本，亞組２于亞組１動(dòng)物處死后２４ｈ采集第二次標(biāo)本。如果采用多次染毒方式，可給予受試

物２次～４次，每次間隔２４ｈ，在末次染毒后１２ｈ～１８ｈ采集一次標(biāo)本。處死動(dòng)物前３ｈ～５ｈ，按４ｍｇ／

ｋｇ

體重腹腔注射秋水仙素。

５．４．２取材

頸椎脫臼法處死動(dòng)物，迅速取出股骨，剔去肌肉，擦凈血污，剪去兩端骨骺，用帶針頭的注射器吸取

５ｍＬ生理鹽水，插入骨髓腔，將骨髓洗入１０ｍＬ離心管，然后用吸管吹打骨髓團(tuán)塊使其均勻，將細(xì)胞懸

液以１０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄去上清液。

５．４．３低滲

離心后的沉淀物加入７ｍＬ０．０７５ｍｏｌ／Ｌ氯化鉀溶液，用滴管將細(xì)胞輕輕吹打均勻，放入３７℃水浴

中低滲１０ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。

５．４．４預(yù)固定

立即加入１ｍＬ～２ｍＬ固定液（甲醇∶冰醋酸＝３∶１），以１０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄去上清液。

５．４．５固定

加入７ｍＬ固定液，混勻，固定１５ｍｉｎ后，以１０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄去上清液，用同法再加固

定液１次～２次，棄去上清液。

５．４．６滴片

加入數(shù)滴新鮮固定液，用滴管充分混勻。將細(xì)胞懸液均勻的滴于冰水玻片上，輕吹細(xì)胞懸液擴(kuò)散平

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４

鋪于玻片上。每個(gè)標(biāo)本制２張～３張玻片，空氣中自然干燥。

５．４．７染色

用Ｇｉｅｍｓａ染液染色１５ｍｉｎ，去離子水沖洗，空氣中自然干燥。

５．４．８閱片

在低倍鏡下檢查制片質(zhì)量，制片應(yīng)為全部染色體較集中，而各個(gè)染色體分散、互不重疊、長(zhǎng)短收縮適

中、兩條單體分開、清楚地顯示出著絲點(diǎn)位置、染色體呈紅紫色。用油鏡進(jìn)行細(xì)胞中期染色體分析，每只

動(dòng)物分析１００個(gè)中期相細(xì)胞，每個(gè)劑量組不少于１０００個(gè)中期分裂相細(xì)胞。在讀片時(shí)應(yīng)記錄每個(gè)觀察

細(xì)胞的染色體數(shù)目，對(duì)于畸變細(xì)胞還應(yīng)記錄顯微鏡視野的坐標(biāo)位置及畸變類型。由于低滲等機(jī)械作用

的破壞，會(huì)導(dǎo)致處于中期的染色體發(fā)生丟失，所以，觀察的中期相染色體數(shù)目應(yīng)控制在２狀±２內(nèi)。

５．５觀察指標(biāo)

５．５．１染色體數(shù)目的改變

５．５．１．１非整倍體：亞二倍體或超二倍體。

５．５．１．２多倍體：染色體成倍增加。

５．５．１．３核內(nèi)復(fù)制：核膜內(nèi)的特殊形式的多倍化現(xiàn)象。

５．５．２染色體結(jié)構(gòu)的改變

５．５．２．１斷裂：損傷長(zhǎng)度大于染色體的寬度。

５．５．２．２微小體：較斷片小而呈圓形。

５．５．２．３有著絲點(diǎn)環(huán)：帶有著絲點(diǎn)部分，兩端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)并伴有一雙無著絲點(diǎn)斷片。

５．５．２．４無著絲點(diǎn)環(huán)：成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

５．５．２．５單體互換：形成三輻體、四輻體或多種形狀的圖像。

５．５．２．６雙微小體：成對(duì)的染色質(zhì)小體。

５．５．２．７裂隙：損傷的長(zhǎng)度小于染色單體的寬度。

５．５．２．８非特定性型變化：如粉碎化、著絲點(diǎn)細(xì)長(zhǎng)化、

黏著等。

６數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評(píng)價(jià)

６．１數(shù)據(jù)處理

每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為一個(gè)觀察單位，每組動(dòng)物按性別分別計(jì)算染色體結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞百分率。若雌、雄

動(dòng)物之間無明顯的性別差異，可合并計(jì)算結(jié)果。可用χ２檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。裂隙應(yīng)單獨(dú)記錄和

報(bào)告，但一般不計(jì)入總的畸變率。

６．２結(jié)果評(píng)價(jià)

結(jié)果評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)從生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義兩個(gè)方面進(jìn)行分析。劑量組染色體畸變率與陰性對(duì)照組

相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并呈劑量反應(yīng)關(guān)系或一個(gè)劑量組出現(xiàn)染色體畸變細(xì)胞數(shù)明顯增高并具有統(tǒng)計(jì)

學(xué)意義，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)，即可確認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，則應(yīng)進(jìn)行

重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果能重復(fù)者可確定為陽(yáng)性。

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７試驗(yàn)報(bào)告

７．１試驗(yàn)名稱、試驗(yàn)單位名稱和聯(lián)系方式、

報(bào)告編號(hào)。

７．２試驗(yàn)委托單位名稱和聯(lián)系方式、

樣品受理日期。

７．３試驗(yàn)開始和結(jié)束日期、試驗(yàn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、

試驗(yàn)單位技術(shù)負(fù)責(zé)人或授權(quán)簽字人、簽發(fā)日期。

７．４試驗(yàn)摘要。

７．５受試物：名稱、批號(hào)、劑型、

性狀（包括感官、性狀、包裝完整性、標(biāo)識(shí)）、數(shù)量、前處理方法、溶媒。

７．６實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：物種、品系、級(jí)別、

數(shù)量、體重、性別、來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)），動(dòng)物檢

疫、適應(yīng)情況，飼養(yǎng)環(huán)境（溫度、相對(duì)濕度、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物