Gs15994一1995

前言

流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，主要通過空氣飛沫傳播。流感病毒

有甲、乙、丙三個(gè)型，其中甲型所引起的流感流行最為廣泛和嚴(yán)重，乙型常引起爆發(fā)，丙型則多引起小兒

散發(fā)病型。在我國雖將該病歸屬于法定丙類傳染病，但一旦流行，傳播快、波及面廣，對(duì)人民健康及勞動(dòng)

生產(chǎn)力有很大影響，而且對(duì)年老體弱多病者及嬰幼兒的威脅較大。為貫徹執(zhí)行《中華人民共和國傳染病

防治法》及《中華人民共和國傳染病防治法實(shí)施辦法》，特制定本標(biāo)準(zhǔn)

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A是標(biāo)準(zhǔn)的附錄;

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄B、附錄C都是提示的附錄

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國衛(wèi)生部提出。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人陶三菊。

本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托技術(shù)歸口單位衛(wèi)生部傳染病防治監(jiān)督管理辦公室負(fù)責(zé)解釋。

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則

GB15994一1995

Diagnosticcriteriaandprinciplesofmanagementofinfluenza

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了流感的診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于各級(jí)各類醫(yī)療、衛(wèi)生、保健機(jī)構(gòu)和人員對(duì)流感的診斷、報(bào)告和處理的應(yīng)用。

2診斷原則

流感流行時(shí)一般根據(jù)臨床癥狀、結(jié)合流行病學(xué)可對(duì)病人作出初步診斷。如確定診斷則需要分離病毒

陽性或病人雙份血清抗體，測(cè)定恢復(fù)期抗體較急性期增高4倍或以上。

3診斷標(biāo)準(zhǔn)

3.1流行病學(xué)史

在流行季節(jié)一個(gè)單位或地區(qū)同時(shí)出現(xiàn)大量上呼吸道感染病人;或近期內(nèi)本地區(qū)或鄰近地區(qū)上呼吸

道感染病人明顯增多;或醫(yī)院門診上呼吸道感染病人明顯增多。

3.2臨床癥狀

3.2.1出現(xiàn)急起畏寒、高熱、頭痛1頭暈、全身酸痛、乏力等中毒癥狀。

3.2.2可伴有咽痛、干咳、流鼻涕、流淚等呼吸道癥狀。

3.2.3少數(shù)病例有食欲減退，伴有腹痛、腹脹、嘔吐和腹瀉等消化道癥狀。

3.3實(shí)驗(yàn)室診斷

3.3.1血液化驗(yàn)檢查白細(xì)胞總數(shù)不高或偏低。

3.3.2從病人鼻咽分泌物分離到流感病毒(見附錄A)e

3.3.3恢復(fù)期病人血清中抗流感病毒抗體滴度比急性期有4倍或4倍以上升高(見附錄B)o

13.4直接檢查呼吸道上皮細(xì)胞的流感病毒抗原陽性(見附錄C中C1),

13.5標(biāo)本經(jīng)敏感細(xì)胞增殖1代后查抗原陽性(見附錄C中C2),

3.4病例分類

3.4-1疑似病例

具備3.1加3.2或3.1加3.2加3.3.1e

3.4.2確診病例

疑似病例加3.3.2或3.3.3或3.3.4或3.3.5.

4處理原則

4門旱期隔離病人、對(duì)癥治療病人和防治合并癥

早期發(fā)現(xiàn)病人、早期隔離病人是最重要的措施。對(duì)病人治療一般采用對(duì)癥治療。防治并發(fā)癥主要應(yīng)

防止流感病毒性肺炎和細(xì)菌性肺炎，特別是對(duì)年老體弱者或伴有心血管、慢性呼吸道疾病者或嬰幼兒，

國家技術(shù)監(jiān)督局1995門2一15批準(zhǔn)1996一07一01Ova

GB15994一1995

流感本身或其合并癥可能引起死亡，應(yīng)特別注意加強(qiáng)治療護(hù)理。

42預(yù)防措施

般采用綜合性預(yù)防措施，講究衛(wèi)生，注意體格鍛煉和營養(yǎng)，保持室內(nèi)空氣流通;對(duì)易感人群應(yīng)采取

相對(duì)隔離措施，如避免接觸病人，不去公共場(chǎng)所等;對(duì)年老體弱者必要時(shí)可采用滅活疫苗接種或服用金

剛烷胺等預(yù)防方法(但須注意金剛烷胺僅對(duì)防治甲型流感有效)

GB15994一1995

附錄A

(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)

病原學(xué)診斷方法

A1病毒分離

從疑似流感病人呼吸道采集標(biāo)本分離病原體。

A2標(biāo)本的收集和處理

A2.1標(biāo)本收集時(shí)間應(yīng)于發(fā)病早期((1-3d內(nèi))越早越好。

A2.2標(biāo)本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法。棉拭子擦抹法用于采集兒童標(biāo)本，采集時(shí)將滅

菌棉拭子稍沾標(biāo)本收集液(pH7.2-7.6含20%-40%滅菌肉湯的生理鹽水或Hanks液或生理鹽水)，

反復(fù)擦拭患者咽部數(shù)次，然后將此棉拭子放進(jìn)裝有上述收集液的試管中塞上棉塞。咽喉洗漱法用于采集

成人標(biāo)本，采集時(shí)先讓患者咳嗽，然后用lOmL左右的收集液反復(fù)洗漱咽喉部約lmin，吐入管內(nèi)。如有

條件，兒童標(biāo)本用負(fù)壓抽吸法抽取鼻咽分泌物，成人標(biāo)本用鼻咽洗液，可提高分離的陽性率。標(biāo)本采集后

羚冰壺(4'C)中盡快送實(shí)驗(yàn)室。

A2.3標(biāo)本的處理:用毛細(xì)吸管反復(fù)吹打標(biāo)本液(如為咽拭子標(biāo)本，先反復(fù)擠壓咽拭子后棄之)，將粘液

打散，于4'C靜置5-10min，待自然沉淀后取3mL上清，按每毫升加青霉素100。單位和鏈霉素l000pig,

混勻置4C處理2-4h即可接種。如標(biāo)本污染較重，可置4‘C過夜處理。如預(yù)計(jì)標(biāo)本在48h內(nèi)不能完成

接種時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本置低溫(最好一70'C)保存。

A3接種及培養(yǎng)法

最常用雞胚培養(yǎng)法和組織培養(yǎng)法，有條件的亦可同時(shí)用兩種方法進(jìn)行病毒分離。

A3門雞胚培養(yǎng)法:取9.11日齡雞胚，將處理過的標(biāo)本液經(jīng)羊膜腔和尿囊腔各接種0.2mL，每份標(biāo)本

接種3-4只胚，置33-35'C溫箱培養(yǎng)3d，然后將雞胚放置4℃冰箱過夜(或置一20℃冰箱1h再置40C

數(shù)小時(shí))即可分別收獲尿液和羊水，并作初步血凝(其方法是用毛細(xì)吸管取1^-2滴尿液或羊水，置大孔

塑料板內(nèi)，再加入1-2滴1%雞紅細(xì)胞，搖勻后置室溫或40C30~45min觀察結(jié)果，根據(jù)血球凝集程度

的不同可分為++++、+++、++、+、士、一)，如血凝為+++~++十十時(shí)，再按系列倍比稀釋測(cè)

定其血凝滴度，如具有一定血凝滴度即可鑒定。如血凝陰性，可盲傳2代，如仍為陰性則棄之。

A3.2組織培養(yǎng)法:用0.2mL處理過的標(biāo)本液接種于長(zhǎng)成單層的原代人胚腎(或猴腎或地鼠腎)，或狗

腎傳代細(xì)胞(MadinDarbyCanineKidney,MDCK)，每份標(biāo)本接種4管，置37℃吸附1-2h后棄標(biāo)本

液，再加入每毫升含2pg胰酶的199維持液1mL，于33℃培養(yǎng)7-10a，并逐日觀察病變。從第三天開始

每隔一天用。4%雞或豚鼠紅細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)管做紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)(試驗(yàn)前無菌法收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液)，

如陰性則用已收獲的上清液盲目傳代，如陽性則測(cè)定上清液的血凝滴度。如標(biāo)本第1代紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)

陰性，可用收獲的全部上清液混合進(jìn)行盲傳2代，仍為陰性則棄之。

A4新分離株的鑒定

新分離流感病毒可用血凝抑制、補(bǔ)體結(jié)合、中和以及血細(xì)胞吸附抑制等試驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定最常用

和最簡(jiǎn)單的方法是血凝抑制試驗(yàn)，必要時(shí)采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。

A4門血凝抑制試驗(yàn):用當(dāng)前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清與新分離流感病毒做

血凝抑制試驗(yàn)，觀察新分離株能否被免疫血清所抑制。血凝抑制試驗(yàn)方法見附錄Bo

A4.2紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn):取紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)陽性的組織培養(yǎng)管和正常細(xì)胞對(duì)照管，用Hanks液洗

細(xì)胞2次，加入經(jīng)霍亂濾液(RDE)處理(1:10)的免疫血清。.2mL，再加入HanksO.6mL，室溫作用

GB15994一1995

30min后，再加入。.4寫雞(或豚鼠)紅細(xì)胞0.2mL,置室溫30min后于普通光學(xué)顯微鏡下觀察有無血球

吸附如果血細(xì)胞吸附被所用免疫血清所抑制，表明所分離的病毒與所用免疫血清型別相一致或接近

A4-3補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)如果用已知的甲型(甲3、甲1)或乙型或丙型流感病毒免疫血清對(duì)新分離病毒的

血凝均不能抑制，則應(yīng)考慮可能為甲型流感病毒的新亞型，可用針對(duì)甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫

血清作補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)定型。

附錄B

(提示的附錄)

血清學(xué)診斷方法

B1血凝抑制試驗(yàn)方法

B1門原理

一些動(dòng)物紅細(xì)胞(如雞、豚鼠等)以及人“O"型血紅細(xì)胞上有流感病毒受體，遇流感病毒可產(chǎn)生紅細(xì)

胞凝集現(xiàn)象，簡(jiǎn)稱血凝。若將特異性抗體與流感病毒(血凝素)預(yù)先作用后再加入紅細(xì)胞則不產(chǎn)生凝集，

稱為血凝抑制現(xiàn)象用定量血凝素與不同稀釋度血清抗體作用后，能完全抑制血凝的最高稀釋度，即為

血凝抑制抗體效價(jià)

Bl.2主要材料

大孔塑料板，lml_吸管或lml移液器。

Bl.3雙份血清收集及處理

急性期血清于發(fā)病3d內(nèi)采取，恢復(fù)期血清于發(fā)病后2-4周采取。取。-lml已分離的血清加入0.9

(或0.4)ml雀亂濾液(RDE)(即1:10或1:5稀釋)搖勻，于37C水浴中過夜，以去除血清中的非特異

性抑制素，次日段56C水浴50min以滅活多余的RDEo

川.刁流感病毒血凝素制備

流感病毒接種雞胚后48h收獲的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐。為了延遲尿鹽沉淀可先用無

菌生理鹽水做等量稀釋，置4'C備用。

B1.5雞紅細(xì)胞懸液的制備

從靜脈或心臟抽取正常健康雞血，保存于阿氏(Alsevers)液中，置4C保存。用前以生理鹽水洗3

次，末次經(jīng)2OOOr/m二離心lOmin，將紅細(xì)胞用生理鹽水配成1%濃度。

B1.6血凝素滴定

將流感病毒血凝素在大孔塑料板內(nèi)用生理鹽水從1:5開始做系列倍比稀釋，每孔。.25mL再加入

等量1%雞紅細(xì)胞，搖勻，置室溫或4'C30-45min后觀察結(jié)果，以出現(xiàn)++血凝的血凝素最高稀釋度為

其血凝效價(jià)，即為1個(gè)血凝單位，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用4個(gè)血凝素單位，例如血凝素效價(jià)為1:320，為1個(gè)單位，

4個(gè)單位即為1:80稀釋。正式實(shí)驗(yàn)前經(jīng)校對(duì)取4個(gè)血凝單位用于實(shí)驗(yàn)。

Bl.7血凝抑制試驗(yàn)步驟

Bl.7門將t_述已處理的待檢血清(1:10或1:5)再用生理鹽水做系列倍比稀釋，每孔加0.25mL,

Bl.7.2加入等量已配好的4個(gè)單位血凝素。

Bl.7.3每孔加入0.25mL1%雞紅細(xì)胞，搖勻置室溫或4'C30-45mino

B1.8結(jié)果觀察

觀察結(jié)果時(shí)將血凝板傾斜數(shù)十秒鐘，待陰性孔內(nèi)紅細(xì)胞自由下滑呈淚滴狀時(shí)讀結(jié)果以出現(xiàn)完全抑

制的血清最高稀釋度的倒數(shù)為抗體的效價(jià)。在檢測(cè)患者雙份血清時(shí)需在同一次試驗(yàn)中進(jìn)行，并以恢復(fù)期

血清抗體效價(jià)較急性期抗體效價(jià)升高4倍或4倍以上為陽性。

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B2型特異性補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

B2.1原理

甲、乙、丙三個(gè)型流感病毒各具有特異的可溶性抗原(核蛋白抗原)，甲型流感病毒各亞型均具有相

同的可溶性抗原，與乙型或丙型的可溶性抗原完全不同，因此可利用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)來區(qū)別它們。當(dāng)流感

病毒出現(xiàn)很大的變異或出現(xiàn)新亞型而引起大流行時(shí)，由于來不及充分掌握新分離毒株的性狀，常需同時(shí)

采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)對(duì)新毒株進(jìn)行血清學(xué)診斷。

B2.2型特異免疫血清制備

B2.2.1免疫用抗原

甲型為PR8株和乙型為L(zhǎng)ee株均為小鼠適應(yīng)株。于乙醚麻醉下鼻腔感染12-16g小鼠，每鼠

。05-1，待感染后3-5d大部分小鼠發(fā)病、部分死亡時(shí)，解剖小鼠。取肺研磨并用生理鹽水制成10%的

懸液，低速離心去除粗塊，取上清鼠肺懸液即為免疫用抗原。

B2.2.2免疫血清制備

選體重300---500g的健康豚鼠，免前采血3-5mL，分離血清分裝凍存留作對(duì)照。豚鼠用乙醚輕度

麻醉，鼻腔滴入上述鼠肺懸液抗原。.5mL，共免疫3-4次，每次間隔一周，在末次免疫的同時(shí)，由腹腔

注射鼠肺懸液2mL，一周后試血，如果對(duì)同型尿膜抗原的血清效價(jià)超過1:80，而與異型抗原無交叉反

應(yīng)，立即采血分離血清分裝凍存于低溫(-20'C以下)。試驗(yàn)前血清于56℃水浴滅活30min,

B2.3可溶性抗原的制備

用甲、乙型流感病毒或新分離病毒按常規(guī)接種和收獲尿囊液，如尿液血凝在1:40以上時(shí)，收獲其

尿囊膜，將尿囊膜用鹽水洗一次，用無菌剪刀將膜剪成數(shù)小塊放入試管中，每個(gè)雞胚的尿囊膜加1MI無

菌生理鹽水，凍化三次，末次化后以3OOOr/min離心15min，吸出上清即為可溶性抗原，加入1:10000

的硫柳汞防腐，置4℃冰箱至少可用一個(gè)月。

B2.4雙份血清采集

收集病人急性期(發(fā)病3d內(nèi))和恢復(fù)期(發(fā)病10-30d后)的血清。血清于試驗(yàn)前560C30min滅活。

B2.510a綿羊紅細(xì)胞懸液制備、溶血素、補(bǔ)體的制備和滴定按常規(guī)方法。

B2.6補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)步驟

按常規(guī)進(jìn)行。

B27結(jié)果判定

B2.7.1被檢病毒尿膜抗原與甲型(或乙型)流感病毒免疫血清呈陽性反應(yīng)則可診斷為甲型(或乙型)

流感病毒.如甲、乙均為陰性時(shí)，應(yīng)考慮丙型流感病毒或其他病毒。

82.7.2雙份血清對(duì)甲型(或乙型)抗原有4倍或4倍以上升高，即可診斷為甲型(或乙型)流感病毒感

染。

B2.7.3正常人群補(bǔ)體結(jié)合抗體滴度一般在1:16以下，如單份恢復(fù)期血清抗體在1:32以上時(shí)，結(jié)

合臨床癥狀可作診斷的參考。

B2.7.4人群血清抗體水平調(diào)查中，補(bǔ)體結(jié)合抗體在1:32以上者可作為新近感染流感的證據(jù)。

B3神經(jīng)氮酸酶抑制試驗(yàn)

B3.1原理

胎球蛋白((Fetuin)底物經(jīng)流感病毒的神經(jīng)氨酸酶作用后，使N一乙酞神經(jīng)氨酸游離出來，經(jīng)過碘酸鹽

的氧化作用將N一乙酞神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)化為各甲醛丙酮酸，后者經(jīng)硫代巴比妥酸作用形成生色團(tuán)，用有機(jī)溶

劑提取生色團(tuán)，并在分光光度計(jì)上比色。利用上述反應(yīng)可測(cè)知流感病毒的神經(jīng)氨酸酶活性，反應(yīng)的顏色

越深酶活性越強(qiáng)。并可選擇用于神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)劑量。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)是將標(biāo)化好劑

++的神經(jīng)氨酸酶(即一定稀釋度的流感病毒尿囊液)和系列稀釋的被檢血清和正常血清一起孵育，測(cè)知

GB15994一1995

血清作用于神經(jīng)氨酸酶活性的抑制效價(jià)，并計(jì)算出血清的神經(jīng)氨酸酶抑制滴度。

B3.2器材及試劑

B3.2.1小試管、IOmL吸管及分光光度計(jì)等。

B3.2.2磷酸緩沖液(PBSpH5.9)及生理鹽水。

B3.2.3胎球蛋白底物液:450^-500mg冰凍干燥的胎球蛋白加蒸餾水1oml_,溶解后置4'C保存，每周

新配。

B3.2.4過碘酸鈉溶液:稱4.8g過碘酸鈉(NaIO,)溶于38mL蒸餾水中，加62mL正磷酸(濃)，充分混

合，段于棕色磨日瓶中，室溫保存

B3.2.5砷試劑:稱log砷酸鈉(N.AsO,)和7.1g無水硫酸鈉溶于100mL蒸餾水中，加0.3mL濃硫

酸，,'6于帶玻璃塞的瓶中，置4(保存

B3.2.6硫代巴比妥酸試劑稱1.2g硫代巴比妥酸和14.2g無水硫酸鈉加入200mL蒸餾水中，在煮沸

的水浴中加熱溶解.每周新配

B3.2.7酸化丁醇試劑:于100mL正丁醇中加入5m]濃}m酸，M棕色帶玻璃塞的瓶中室溫保存

B3.3神經(jīng)氨酸酶活性測(cè)定

B3.3.1病毒用生理鹽水做系列倍比稀釋(1:2^1:32)分裝小試管，每管0.1mL標(biāo)準(zhǔn)病毒和未知病

毒的神經(jīng)氨酸酶應(yīng)在同一試驗(yàn)中測(cè)定。

B3.3.2每管補(bǔ)充加入。.lnil生理鹽水，再加入0.1mL用pH5.9PBS配制的胎球蛋白底物，對(duì)照管

用鹽水代替病毒，充分混合后置37C水浴作用18h.

B3.3.3從水浴中取出試管在室溫冷卻，每管加入。.1ml的過碘酸鹽試劑，充分混合，室溫靜置20min

(時(shí){e」要準(zhǔn))

B3.3.4每管加入1mL砷試劑，由于碘的釋放出現(xiàn)棕色，搖動(dòng)試管待棕色消失。

B3.3.5每管加入2.5m1硫代巴比妥試劑，并充分混合(該試劑需在煮沸溶解后加入)，用棉塞將管口

堵’緊

B3.16立刻將試管:R-于煮沸的水浴中，煮沸10min，可見紅色出現(xiàn)，即為神經(jīng)氨酸酶活性的表現(xiàn)，顏色

越深酶活性越高。

B3.3.7將試管置冰水中冷卻后去掉棉塞加入4ml.-j-醇試劑，換上干凈橡皮塞，用手劇烈搖動(dòng)試管，

提取顏色使其轉(zhuǎn)到有機(jī)物(丁醇)相

B3.3.8以1500r/min離心5-l0min使丁醇層清亮透明，小心地吸出上層的丁醇，放入干凈的試管中

待檢

B3.19將上述受檢樣品由高稀釋度到低稀釋度依次傾入透光池中，其中第一個(gè)透光池加入無病毒的

對(duì)照管液，將分光光度計(jì)波長(zhǎng)調(diào)至549nm，將對(duì)照管調(diào)至零，然后依次讀取每個(gè)稀釋度樣品的光密度。

B3.3.10酶單位的計(jì)算:酶活性測(cè)定時(shí)光密度為0.45-0.85的病毒稀釋度作為一個(gè)酶單位。

B3.4神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)

B3.4門按上述方法測(cè)定酶活性，選用1個(gè)酶單位的病毒稀釋度(即酶活性測(cè)定時(shí)光密度為。.45-

0.85的病毒稀釋度)，每管加入。.lml

B3.4.2受檢血清做系列倍比稀釋，每管病毒加入不同稀釋度血清。.1mL，血清對(duì)照管是以最低稀釋

度血清加生理鹽水代替病毒，37C水浴作用1h。以同法做正常血清對(duì)照組。

B3.4.3每管加入pH5.9PBS配制的胎球蛋白0.lml，充分搖勻，置37℃水浴中孵育18h,

B3.4.4t!水浴中取出試管，按B3.3.3.^-B3.3.7逐步加入前述各種試劑。

B3.4.5測(cè)定光密度時(shí)應(yīng)從低稀釋度血清管至高稀釋度血清管，檢測(cè)方法同B3.3.9e

B3.5神經(jīng)氨酸酶抑制抗體滴度的計(jì)算法

B3.5門根據(jù)抗血清和正常血清兩組試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，求得侮組血清同一稀釋度的光密度之商數(shù)，即

xj經(jīng)血清作iii后所余之酶活性的百分?jǐn)?shù)。血清稀釋度越高.殘m的酶活性也越高，找出50酶活性前后

GB15994一1995

兩個(gè)血清稀釋度及其相應(yīng)的酶活性百分?jǐn)?shù)，按公式計(jì)算出血清神經(jīng)氨酸酶抑制抗體滴度。

83.5.2計(jì)算公式

，一(B}一。2)興+Bx

(Bl)

式中:A—血清神經(jīng)氨酸酶抑制抗體效價(jià)倒數(shù);

B,酶活性高于50%的血清稀釋度倒數(shù)

執(zhí)—酶活性低于50%的血清稀釋度倒數(shù)

C—高于50%的酶活性的百分?jǐn)?shù);

C—低于50%的酶活性的百分?jǐn)?shù);

5?！?shù)。

B3.5.3計(jì)算舉例

先計(jì)算血清作用后的酶活性:

血清稀釋度(0.51oa10

1.01.52.02.53.03.54.0

免疫血清+1單位病毒

正常血清+1單位病毒

神經(jīng)氨酸酶活性，%

0.046"0.0520.0600.0740.2880.4220.592

0.8620.8640.9020.6760.6220.6040.612

56711457097

”光密度。

然后將對(duì)數(shù)稀釋度換算為幾何稀釋度:例如10-'換算為1/1000,10-”換算為1/3200.最后代入公

(3200一1000)

70-45

50-45

+1000=2200令5+1000二1440

此抗血清的神經(jīng)氨酸酶抑制效價(jià)為1:1440.

附錄C

(提示的附錄)

流感快速診斷方法

cl直接檢查呼吸道脫落上皮細(xì)胞內(nèi)抗原

cl門原理

由于流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮細(xì)胞，因此在病人呼吸道標(biāo)本的脫落細(xì)胞中含有流

感病毒抗原，通過直接檢查脫落上皮細(xì)胞內(nèi)抗原即可診斷。檢查方法可采用免疫熒光法，一般于3-4h

內(nèi)即可完成，而且可以直接定型。

c1.2標(biāo)本的收集和制片

兒童標(biāo)本最好采用負(fù)壓抽吸法收集呼吸道分泌物，成人標(biāo)本最好采用鼻咽洗液?？蓪⒚糠輼?biāo)本分為

兩份，一份低溫凍存?zhèn)渥鞑《痉蛛x，一份用pH7.2磷酸緩沖液(PBS)，將粘液吹打散，1500r/min離心

15min去除上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗1-2次，末次離心后棄上清，加人適量pH7.2PBS使細(xì)胞重懸，滴

加于帶圈的玻璃片上，自然干燥，冷丙酮固定10min,

cl.3間接免疫熒光法

cl.3門用10%新鮮羊或牛血清封閉標(biāo)本片，置濕盒中于37`C30min.

C1.3.2分別加入適當(dāng)稀釋度的抗甲型和乙型流感型特異性單克隆抗體，置濕盒中于37℃放置1h。在

PBS中洗兩次，共IOmine

c815994一1995

c1.3.3加適當(dāng)稀釋度的兔抗鼠熒光素結(jié)合物置37C1h。在PBS中洗三次，共lOmin，末次用蒸餾水過

_一F

c1.3.4于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，觀察到三個(gè)以上胞漿內(nèi)或胞核內(nèi)熒光陽性細(xì)胞即可判為陽性。

C2標(biāo)本經(jīng)敏感細(xì)胞增殖，代后查抗原

c2.1原理

病人呼吸道標(biāo)本經(jīng)接種敏感細(xì)胞(狗腎傳代細(xì)胞MDCK)增殖1-3d后，將細(xì)胞消化分散制成抗原

片再用免疫熒光法或免疫酶染法檢查細(xì)胞內(nèi)抗原。由于標(biāo)本中的病毒在敏感細(xì)胞增殖后查抗原，能明

顯提高其診斷的敏感性，可在細(xì)胞病變出現(xiàn)以前查到抗原，可以直接定型，而且比常規(guī)雞胚分離病毒法

要快得多，一般24^-72h即可診斷。檢查方法可采用間接免疫酶染法((C