1、,發(fā)酵過(guò)程,定 義,發(fā)酵過(guò)程即細(xì)胞的生物反應(yīng)過(guò)程，是指由生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞所引起的生物反應(yīng)過(guò)程。它不僅包括了以往“發(fā)酵”的全部領(lǐng)域，而且還包括固定化細(xì)胞的反應(yīng)過(guò)程、生物法廢水處理過(guò)程和細(xì)菌采礦等過(guò)程。,為什么要研究發(fā)酵過(guò)程,微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，而且要賦以合適的環(huán)境條件才能使它的生產(chǎn)能力充分表達(dá)出來(lái)。為此我們必須通過(guò)各種研究方法了解有關(guān)生產(chǎn)菌種對(duì)環(huán)境條件的要求，如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、pH、氧的需求等，并深入地了解生產(chǎn)菌在合成產(chǎn)物過(guò)程中的代謝調(diào)控機(jī)制以及可能的代謝途徑，為設(shè)計(jì)合理的生產(chǎn)工藝提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，為了掌握菌種在發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化規(guī)律，可以通過(guò)各種監(jiān)測(cè)手段如取樣

2、測(cè)定隨時(shí)間變化的菌體濃度，糖、氮消耗及產(chǎn)物濃度，以及采用傳感器測(cè)定發(fā)酵罐中的培養(yǎng)溫度pH、溶解氧等參數(shù)的情況，并予以有效地控制，使生產(chǎn)菌種處于產(chǎn)物合成的優(yōu)化環(huán)境之中。,分批發(fā)酵(Batch fermentation) 補(bǔ)料分批發(fā)酵(Fed-batch fermentation) 連續(xù)發(fā)酵(Continuous fermentation),這節(jié)介紹分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵及連續(xù)發(fā)酵三種類(lèi)型的操作方式下的代謝特征。,發(fā)酵過(guò)程按進(jìn)行過(guò)程有三種方式：,第一節(jié) 發(fā)酵過(guò)程的代謝變化規(guī)律,1、分批發(fā)酵的定義 是指在一封閉系統(tǒng)內(nèi)含有初始限量基質(zhì)的發(fā)酵方式。在這一過(guò)程中，除了氧氣、消泡劑及控制pH的酸或堿外，不再

3、加入任何其它物質(zhì)。發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基成分減少，微生物得到繁殖。,一、分批發(fā)酵,2、分批發(fā)酵的特點(diǎn),微生物所處的環(huán)境在發(fā)酵過(guò)程中不斷變化，其物理，化學(xué)和生物參數(shù)都隨時(shí)間而變化，是一個(gè)不穩(wěn)定的過(guò)程。,優(yōu)點(diǎn) 操作簡(jiǎn)單； 操作引起染菌的概率低; 不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問(wèn)題。 缺點(diǎn) 非生產(chǎn)時(shí)間較長(zhǎng)、設(shè)備利用率低。,3、分批發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn),停滯期,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,穩(wěn) 定 期,死亡期,單細(xì)胞微生物,4、分批發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線,微生物生長(zhǎng)分為：停滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和死亡期。,在遲滯期，菌體沒(méi)有分裂只有生長(zhǎng)，因?yàn)楫?dāng)菌種接種入一個(gè)新的環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)的核酸、酶等稀釋?zhuān)@時(shí)細(xì)胞不能分裂。,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的與細(xì)胞分裂相關(guān)的物質(zhì)濃度

4、達(dá)到一定程度，細(xì)胞開(kāi)始分裂，這時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)很快，比生長(zhǎng)速率幾近常數(shù)，這個(gè)時(shí)期稱(chēng)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。,隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物減少，廢物積累，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降，進(jìn)入減速期和穩(wěn)定期。最后當(dāng)細(xì)胞死亡速率大于生成速率，進(jìn)入死亡期。,對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期就開(kāi)始合成并積累，而次級(jí)代謝產(chǎn)物則在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期和穩(wěn)定期大量合成。,5、分批發(fā)酵的類(lèi)型,Gadens fermentation classification （按照菌體生長(zhǎng)，碳源利用和產(chǎn)物生成的變化） 第一類(lèi)型 第二類(lèi)型 第三類(lèi)型,Pirets fermentation classification （按照產(chǎn)物生成與菌體生長(zhǎng)是否同步）

5、生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型 (第一類(lèi)型） 生長(zhǎng)無(wú)關(guān)聯(lián)型（第二，三類(lèi)型）,第一類(lèi)型（生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型）,產(chǎn)物直接來(lái)源于產(chǎn)能的初級(jí)代謝（自身繁殖所必需的代謝），菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成不分開(kāi)。 例如單細(xì)胞蛋白和葡萄糖酸的發(fā)酵,第二類(lèi)型（部分生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型）,產(chǎn)物也來(lái)源于能量代謝所消耗的基質(zhì)，但產(chǎn)物的形成在與初級(jí)代謝分開(kāi)的次級(jí)代謝中，出現(xiàn)兩個(gè)峰，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，出現(xiàn)產(chǎn)物形成高峰。 例如，檸檬酸和某些氨基酸的發(fā)酵。,第三類(lèi)型（非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型）,產(chǎn)物是在基質(zhì)消耗和菌體生長(zhǎng)之后，菌體利用中間代謝反應(yīng)來(lái)形成的，即產(chǎn)物的形成和初級(jí)代謝是分開(kāi)的。 如抗生素發(fā)酵。,產(chǎn)物形成與生長(zhǎng)有關(guān)，如酒精、某些酶等。,生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型 （growth assoc

6、iated ）,產(chǎn)物的形成速度與生長(zhǎng)無(wú)關(guān)，只與細(xì)胞積累量有關(guān)。如，抗生素。,非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型 non-growth associated,分批發(fā)酵的分類(lèi)對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義,從上述分批發(fā)酵類(lèi)型可以分析： 如果生產(chǎn)的產(chǎn)品是生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型（如菌體與初級(jí)代謝產(chǎn)物），則宜采用有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，延長(zhǎng)與產(chǎn)物合成有關(guān)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 如果產(chǎn)品是非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型（如次級(jí)代謝產(chǎn)物），則宜縮短對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并迅速獲得足夠量的菌體細(xì)胞后延長(zhǎng)平衡期，以提高產(chǎn)量。,二、補(bǔ)料分批發(fā)酵,1、定義 補(bǔ)料分批發(fā)酵又稱(chēng)半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過(guò)程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。,2、補(bǔ)料發(fā)酵補(bǔ)加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有：,補(bǔ)充

7、菌體所需的能源和碳源； 補(bǔ)充菌體所需氮源； 加入某些菌體生長(zhǎng)代謝所需的微量元素和無(wú)機(jī)鹽； 對(duì)于產(chǎn)誘導(dǎo)酶的微生物，常在補(bǔ)料中適當(dāng)加入該酶的作用底物，以提高酶的產(chǎn)量； 對(duì)一些抗生素發(fā)酵，往往需要補(bǔ)充抗生素形成的前體。,3、補(bǔ)料分批發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn) 使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度； 和連續(xù)發(fā)酵比、不需要嚴(yán)格的無(wú)菌條件； 不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問(wèn)題。 缺點(diǎn) 存在一定的非生產(chǎn)時(shí)間； 和分批發(fā)酵比，中途要流加新鮮培養(yǎng)基，增加了染菌的危險(xiǎn)。,三、連續(xù)發(fā)酵,1、定義 培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時(shí)放出含有產(chǎn)品的相同體積發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)料液量維持恒定，微生物在近似恒定狀態(tài)（恒定的基質(zhì)濃度、恒定的產(chǎn)物濃度

8、、恒定的pH、恒定菌體濃度、恒定的比生長(zhǎng)速率）下生長(zhǎng)的發(fā)酵方式。,2、連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn) 能維持低基質(zhì)濃度； 可以提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量； 便于自動(dòng)控制。 缺點(diǎn) 菌種發(fā)生變異的可能性較大； 要求嚴(yán)格的無(wú)菌條件。,3、連續(xù)發(fā)酵的類(lèi)型,恒化培養(yǎng) 使培養(yǎng)基中限制性基質(zhì)的濃度保持恒定 恒濁培養(yǎng) 使培養(yǎng)基中菌體的濃度保持恒定,第二節(jié) 發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)的基本概念, 發(fā)酵過(guò)程的反應(yīng)描述及速度概念, 發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究的基本內(nèi)容, 菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成、基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)的基本概念,一、 發(fā)酵過(guò)程的反應(yīng)描述及速度概念,發(fā)酵過(guò)程反應(yīng)的描述,X S（底物） X（菌體） P（產(chǎn)物）,發(fā)酵研究的內(nèi)容：,菌種的來(lái)源

9、找到一個(gè)好的菌種,發(fā)酵過(guò)程的工藝控制最大限度發(fā)揮菌種的潛力,基質(zhì)的消耗速度：,發(fā)酵過(guò)程反應(yīng)速度的描述,基質(zhì)的消耗比速：,(g.L-1.s-1),(h-1、s-1),單位時(shí)間內(nèi)單位菌體消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物（菌體）的量稱(chēng)為比速，是生物反應(yīng)中用于描述反應(yīng)速度的常用概念。,X S（底物） X（菌體） P（產(chǎn)物）,基質(zhì)的比消耗速度：,(h-1),菌體的比生長(zhǎng)速度：,產(chǎn)物的比形成速度：,(h-1),(h-1),發(fā)酵過(guò)程反應(yīng)速度的描述,X S（底物） X（菌體） P（產(chǎn)物）,二、 發(fā)酵反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究?jī)?nèi)容,研究反應(yīng)速度及其影響因素并建立反應(yīng)速度與影響因素的關(guān)聯(lián),反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型,反應(yīng)器特性,+,反應(yīng)器的操作模型

10、,操作條件與反應(yīng)結(jié)果的關(guān)系，定量地控制反應(yīng)過(guò)程,已建立動(dòng)力學(xué)模型的類(lèi)型,機(jī)制模型：,根據(jù)反應(yīng)機(jī)制建立,幾乎沒(méi)有,現(xiàn)象模型（經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?目前大多數(shù)模型,能定量地描述發(fā)酵過(guò)程,能反映主要因素的影響,三 微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的基本概念,（一）、微生物在一個(gè)密閉系統(tǒng)中的生長(zhǎng)情況：,時(shí)間,菌體濃度,延遲期,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,減速期,靜止期,衰亡期,延遲期：,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期:,倍增時(shí)間：td,減速期:,靜止期： ;,衰亡期:,典型微生物的生長(zhǎng)速度,(二)、微生物的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、Monod方程,微生物的比生長(zhǎng)速度： f(s,p,T,pH,),在一定條件下(基質(zhì)限制)： f(S),Monod研究了基質(zhì)濃度與比生長(zhǎng)速度的關(guān)系

11、 Monod方程(1942),米氏方程:,：菌體的比生長(zhǎng)速度 S：限制性基質(zhì)濃度 Ks：飽和常數(shù) max: 最大比生長(zhǎng)速度,單一限制性基質(zhì)：就是指在培養(yǎng)微生物的營(yíng)養(yǎng)物中，對(duì)微生物的生長(zhǎng)起到限制作用的營(yíng)養(yǎng)物。,Monod方程的參數(shù)求解(雙倒數(shù)法)：,將Monod方程取倒數(shù)可得：,或：,這樣通過(guò)測(cè)定不同限制性基質(zhì)濃度下，微生物的比生長(zhǎng)速度，就可以通過(guò)回歸分析計(jì)算出Monod方程的兩個(gè)參數(shù)。,例：在一定條件下培養(yǎng)大腸桿菌，得如下數(shù)據(jù)：,S(mg/l) 6 33 64 153 221 (h-1) 0.06 0.24 0.43 0.66 0.70,求在該培養(yǎng)條件下，求大腸桿菌的max，Ks和td?,解：

12、將數(shù)據(jù)整理：,S/ 100 137.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 221,max，1.11 (h-1); Ks97.6 mg/L,tdln2/ max0.64 h,四 產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)的基本概念,（一）、初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物,次級(jí)代謝產(chǎn)物：還有一類(lèi)產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞的代謝功能沒(méi)有明顯 的影響，一般是在穩(wěn)定期形成，如抗生素等， 這一類(lèi)化合物稱(chēng)為次級(jí)代謝產(chǎn)物。,初級(jí)代謝產(chǎn)物：微生物合成的主要供給細(xì)胞生長(zhǎng)的一類(lèi)物質(zhì)。 如氨基酸、核苷酸等，這些物質(zhì)稱(chēng)為初級(jí) 代謝產(chǎn)物。,（二）、Gaden對(duì)發(fā)酵的三分類(lèi)與Pirt方程：,一類(lèi)發(fā)酵 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)相偶聯(lián),x,p,二類(lèi)發(fā)酵 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)部分偶聯(lián),x,p,三類(lèi)發(fā)酵 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)非偶聯(lián),x,p,Pirt方程,a + b,a=0、b0： 可表示一類(lèi)發(fā)酵,a0、b 0： 可表示二類(lèi)發(fā)酵,a0、b=0：可表示三類(lèi)發(fā)酵,五 基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)的基本概念,S,S1 菌體,S2 產(chǎn)物,S3 維持,X S（底物） X（菌體） P（產(chǎn)物）+維持,維持消耗(