1、基因的定位與克隆,千奇百怪的突變體,這些突變體是怎么產(chǎn)生的呢？,突變體:是某個(gè)性狀發(fā)生可遺傳變異的材料，或某個(gè)基因發(fā)生突變的材料。,水稻,獲得突變體的方法： 1.1 自發(fā)突變 1.2 物理、化學(xué)誘變 1.3 插入突變法 ：T-DNA 插入法 ；轉(zhuǎn)座子法,到底是哪個(gè)基因突變而引起對應(yīng)性狀的改變呢？就需要進(jìn)行基因定位,基因定位（mapping）：是用一定的方法將基因確定到染色體上的實(shí)際位置。,水稻中已克隆的重要基因,水稻白葉枯病抗性基因 Xa21 水稻分蘗控制基因 MOC1 水稻脆稈控制基因 BC1 水稻半矮稈基因SD1 水稻抽穗期基因 Hd1 水稻糊化溫度控制基因 ALK 水稻抗稻瘟病基因Pi-

2、b,一、連鎖分析（Linkage analysis）,1）概念： 基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。,2）重組值（recombination fraction） 是基因定位時(shí)兩個(gè)基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。如果兩個(gè)基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。（centimorgan，cM）交換值(RF)(%)=重組型的配子數(shù)/總配子數(shù)100% 重組值越大，說明兩基因間的距離越遠(yuǎn)，基因間的連鎖強(qiáng)度越?。恢亟M值越小，說明基因間的距離越近，基因間的連鎖強(qiáng)度越大。,3

3、）遺傳標(biāo)記（genetic marker） 用連鎖分析發(fā)法進(jìn)行基因定位需要已知的DNA序列作為遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記按孟德爾方式遺傳，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)是多態(tài)的。 4）遺傳多態(tài)性：是指在一個(gè)遺傳座位上具有一個(gè)以上的等位基因，且各個(gè)等位基因在群體中出現(xiàn)的頻率皆高于1%。,二、三點(diǎn)測交(three-point testcross)與染色體作圖,為了進(jìn)行基因定位，摩爾根和他的學(xué)生Sturtevant創(chuàng)造了三點(diǎn)測交方法，即將3個(gè)基因包括在同一次交配中。進(jìn)行這種測交，一次實(shí)驗(yàn)就等于3次兩點(diǎn)試驗(yàn)。 已知在果蠅中棘眼(ec)、截翅(ct)和橫脈缺失(cv)這3個(gè)隱性突變基因都是X連鎖的。把棘眼、截翅個(gè)體與橫脈缺失個(gè)體交

4、配,得到3個(gè)基因的雜合體ec ct +/+ + cv (ec、ct、cv的排列不代表它們在X染色體的真實(shí)順序)，取其中3雜合體雌蠅再與3隱性體ec ct cv/Y雄蠅測交，測交后代如下表。,ec ct +/ + + cv ec ct cv/Y測交后代數(shù)據(jù),結(jié)果分析,1、歸類 2、確定正確的基因順序 用雙交換型與親本類型相比較，發(fā)現(xiàn)改變了位置的那個(gè)基因一定是處于中央的位置，因?yàn)殡p交換的特點(diǎn)是旁側(cè)基因的相對位置不變，僅中間的基因發(fā)生變動(dòng)。于是可以斷定這3 個(gè)基因正確排列順序是ec cv ct。,ec ct +,+ + cv,ec + ct,+ cv +,ct ec +,+ + cv,ec + +,

5、+ ct cv,ec cv ct,+ + +,ct + +,+ ec cv,3、計(jì)算重組值，確定圖距 (1)、計(jì)算ctcv的重組值 忽視表中第一列(ec/+)的存在，將它們放在括弧中，比較第二、三列：,ctcv間重組率 =(217+223+5+3)/5318 =0.084=8.4%=8.4cM,(2)、計(jì)算eccv的重組值 忽視表中第二列(ct/+)的存在，將它們放在括弧中，比較第一、三列：,eccv間重組率 =(273+265+5+3)/5318 =10.2%=10.2cM,(3)、計(jì)算ecct的重組值 忽視表中第三列(+/cv)的存在，將它們放在括弧中，比較第一、二列：,ecct間重組率

6、=(273+265+217+223)/5318 =18.4%=18.4cM,4、繪染色體圖,在計(jì)算eccv和cvct的重組值時(shí)都利用了雙交換值，可是計(jì)算ecct時(shí)沒把它計(jì)在內(nèi)，因?yàn)樗鼈冮g雙交換的結(jié)果并不出現(xiàn)重組。所以ecct之間的實(shí)際雙交換值應(yīng)當(dāng)是重組值加2倍雙交換值。即18.4%+20.1%=18.6%。 當(dāng)三點(diǎn)測交后代出現(xiàn)8種表型時(shí),表明有雙交換發(fā)生,此時(shí)需用2倍雙交換值來作校正。若3個(gè)基因相距較近，往往不出現(xiàn)雙交換類型,后代只有6種表型,無需校正。,標(biāo)記1,標(biāo)記2,目標(biāo)基因,三、圖位克隆,圖位克?。╩ap-based cloning）又稱定位克隆，該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的

7、位置進(jìn)行基因克隆的一種方法，其原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進(jìn)行精確定位的基礎(chǔ)上，使用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫，從而構(gòu)建的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步行（chromosome walking）逼近目的基因或通過染色體登陸（chromosome landing）（Tanksley et al.，1995）的方法最終找到包含目的基因的克隆，最后通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目的基因的堿基序列。,圖位克隆的特點(diǎn)是無需預(yù)先知道基因的DNA順序，也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息，但應(yīng)有以下兩方面的基本情況。 一是

8、有一個(gè)根據(jù)目的基因的有無建立起來的遺傳分離群體,即定位群體，如：F2、DH、BC、RI等。,二是開展以下幾項(xiàng)工作：（1）首先找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記；（2）用遺傳作圖和物理作圖將目標(biāo)基因定位在染色體上的特定位置；（3）構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫；（BAC或YAC）；（4）以與目的基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫；（5）用獲得陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的重疊群；（6）通過染色體步行、登陸或跳躍獲得帶有目的基因的大片段克?。唬?）通過亞克隆獲得帶有目的基因的小片段克??；（8）通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目標(biāo)基因的堿基序列,M1,M2,構(gòu)建遺傳圖譜,構(gòu)建物理圖譜,染色體步移：

9、Chromosome Walking,篩選基因組文庫,序列分析與功能鑒定,對于基因組還未測序的物種可通過染色體步移的方法進(jìn)行定位，但是比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而對于水稻、擬南芥等基因組測序工作已經(jīng)完成的物種，則不在利用染色體步移的方法進(jìn)行定位，直接從構(gòu)建遺傳圖譜到構(gòu)建物理圖譜，最后確定目標(biāo)基因的候選基因，再通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。,四、分子標(biāo)記,分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。 現(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。,分子標(biāo)記的種類,一、基于分子雜交技術(shù)的分子

10、標(biāo)記技術(shù)：限制性片斷長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 二、基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR) 三、基于限制性酶切和PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記 ：擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP ) 四、基于DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù) ：核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorph

11、ism，SNP),SSR即微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(gè)（多為1-5個(gè)）堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復(fù)。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對特異引物，通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長度多態(tài)性，即SSR標(biāo)記。,SSR,五、基因初步定位,目的基因的初步定位(mapping th

12、e target gene)是利用分子標(biāo)記技術(shù)在一個(gè)目標(biāo)性狀的分離群體中把目的基因定位于染色體的一定區(qū)域內(nèi)。 初定位通常使用近等基因系法(near-isogenic lines, NILs)或群組分離分析法(bulk segregant analysis, BSA)。,近等基因系是指只有目標(biāo)性狀基因有差異，其它性狀基因相同的2個(gè)群體，可以通過連續(xù)回交的途徑獲得。 由于近等基因系需要連續(xù)的回交，所需的時(shí)間較長，因此Michelmore等(1991)提出了群組分離分析法（BSA法），將分離群體中研究的目標(biāo)性狀根據(jù)其類型(如抗病、感病)分成2組，將每組內(nèi)一定數(shù)量的植株DNA 等量混合，形成兩個(gè)池，這

13、兩個(gè)池僅在目標(biāo)性狀(如抗病性)上有差異。利用分子標(biāo)記技術(shù)尋找兩個(gè)池的擴(kuò)增譜帶的差異，這種多態(tài)性極可能與目標(biāo)基因連鎖。再用所有的分離后代單株，驗(yàn)證該多態(tài)性是否真正與目標(biāo)基因連鎖及連鎖距離的確定。,六、精細(xì)定位,在初步定位基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并篩選離親本更近且在兩親本之間表現(xiàn)多態(tài)性的引物，然后利用F2群體中的突變體檢測篩選到的親本間多態(tài)性引物，逐步縮小范圍，將目的基因定位到染色體上一個(gè)很小的物理區(qū)間內(nèi)。,舉例說明：利用SSR標(biāo)記進(jìn)行水稻drawf1基因的定位,基本實(shí)驗(yàn)方法,F2定位群體構(gòu)建 植物總DNA的提取 PCR反應(yīng) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 引物設(shè)計(jì),F2群體構(gòu)建,引物設(shè)計(jì)常用軟件及網(wǎng)站,設(shè)計(jì)軟件： pr

14、imer3.0 /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi primer5.0（尋找酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物） Webprimer /cgi-bin/web-primer 序列分析軟件： DNAstar（分析序列特征，引物質(zhì)量，編輯序列）,水稻實(shí)用網(wǎng)站,NCBI TIGR GRAMENE,基因的初步定位（BSA法）,篩選親本間多態(tài)性引物 篩選池間多態(tài)性引物 小群體驗(yàn)證,初步定位帶型分析,RM1（親本之間有多態(tài)，池間無多態(tài)）,RM2(親本和池之間均有多態(tài)）,總結(jié)：如果親本與池之間同時(shí)存在

15、多態(tài)性的引物很有可能和目標(biāo)基因連鎖，因此再通過小群體進(jìn)行驗(yàn)證（重組交換值應(yīng)該小于50%），則可將目標(biāo)基因定位到與其連鎖的標(biāo)記所在的染色體上。,我們初步定位的結(jié)果是否準(zhǔn)確呢？接下來就要用一些突變體進(jìn)行驗(yàn)證，看一下我們所選定的標(biāo)記與目標(biāo)基因是否真正連鎖,遺傳距離=（單交換+雙交換2）/（突變體總數(shù) 2） 100,怎樣判斷目標(biāo)基因與這些標(biāo)記之間的位置關(guān)系及距離遠(yuǎn)近呢？,A P + - 5 10 18,A P + - 6 11 12 16,RM2,RM3,交換率越高的標(biāo)記離目標(biāo)基因越遠(yuǎn)，反之離目標(biāo)基因越近，即對應(yīng)的交換株越多的標(biāo)記離目標(biāo)基因遠(yuǎn)，交換株越少的標(biāo)記離目標(biāo)基因越近。,RM1,RM2,draw

16、f1,RM3,RM4,3.8cM,2.4cM,2.4cM,2.0cM,CHR.6,Marker,Dist.(cM),目標(biāo)基因所在區(qū)域的分子標(biāo)記連鎖圖,精細(xì)定位,擴(kuò)大定位群體 設(shè)計(jì)離目標(biāo)基因更近的分子標(biāo)記，并篩選在兩親本之間存在多態(tài)性的分子標(biāo)記 用篩選出的多態(tài)性標(biāo)記引物檢測定位群體，最終將目標(biāo)基因鎖定在一個(gè)較小的物理區(qū)間內(nèi),目標(biāo)基因所在染色體上相應(yīng)區(qū)段的跨疊BAC克隆群,七、候選基因的確定,方法（1）查閱相關(guān)資料，比較分析定位區(qū)間內(nèi)基因的同源基因的功能，在其它物種是否引起相同或相似的表型，找到最有可能的候選基因；（2）進(jìn)行mRNA水平的分析，看其表達(dá)在正常植株與突變體中是否發(fā)生了改變，如長度變化，表達(dá)量變化等；（3）進(jìn)行序列測定，比較該基因在正常植株內(nèi)與突變體內(nèi)核酸序列和氨基酸序列是否發(fā)生了改變；（4）