1、第一部分,核酸的制備（分離、純化）,核酸的制備（分離、純化）,一、總論 二、以質(zhì)粒DNA為例談DNA的分離純化 三、以真核生物為代表介紹總RNA的純化 四、核酸的進(jìn)一步純化（聚乙二醇、氯化銫梯度離心,問(wèn)題：,分離核酸的基本依據(jù)、方法？ 核酸分離主要需要注意的是什么？ DNA和RNA分離時(shí)的主要差別？,不同的生物體中，核酸所處的環(huán)境不盡相同：1、核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密程度不同。2、DNA與RNA含量有差別。3、核酸分子量大小有差別。4、. 由于核酸性質(zhì)基本相同，生物體所組成的成分基本相同，因此，對(duì)于不同的生物體核酸的分離方法相差不大。,以上是常見(jiàn)核苷酸結(jié)構(gòu)，中性PH下的離子狀態(tài)的鈉鹽形式。 結(jié)構(gòu)決

2、定性質(zhì)，性質(zhì)是分離的基礎(chǔ)。,核酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：,分子巨大，有共扼雙鍵、氫鍵、苷鍵、和磷酸二酯鍵，自由氨基、磷酸基。 核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)；RNA大多為單鏈，鏈的許多區(qū)域或自身發(fā)生回折，回折區(qū)內(nèi)的多核苷酸段呈螺旋結(jié)構(gòu)。,核酸性質(zhì)核酸性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)和組分是密切相關(guān)的,分子量大?。篟NA和DNA的分子量都很大。RNA分子量104-106 或者更大。DNA分子量1.6106-2.2 109 。 性狀和溶解度：DNA多為白色纖維狀固體。RNA為白色粉末。都微溶于水，他們的鈉鹽在水中溶解度較大，都溶于2-甲氧乙醇，但不溶于一般有機(jī)溶劑（如：乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等）。 吸收光譜：具有共扼

3、雙鍵的嘌呤和嘧啶，故皆具有獨(dú)特的紫外吸收光譜。核酸在240-260nm的紫外波段有強(qiáng)烈的吸收峰。最大吸收值在260nm附近。通過(guò)OD260/OD280 的比值可判斷樣品的純度。純DNA的OD260/OD280 =1.8，純RNA的OD260/OD280 =2.0。核酸中若含雜蛋白或苯酚則比值明顯降低。 對(duì)于純核酸樣品只要讀出260nm的OD值，即可算出含量，通常：1OD260 =50ug/ml（雙螺旋DNA）、 1OD260 =40ug/ml（單螺旋DNA或RNA）、 1OD260 =20ug/ml（寡核苷酸）。 變性：加熱、強(qiáng)酸堿或射線及一切可破壞核酸分子氫鍵的處理。變性后的核酸理化性質(zhì)、生

4、物功能都會(huì)有顯著變化，最重要表現(xiàn)為粘度下降。 降解：酸、堿、核酸酶都可使核酸不同程度的降解。,分離核酸共同要考慮的,防止核酸變性與降解：低溫操作。分離過(guò)程需加入必要的核酸解聚酶的抑制劑（如： 乙二胺四乙酸（EDTA）、檸檬酸鹽、皂土、8-羥基喹啉、SDS、苯酚等） 脫蛋白：在生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合以核蛋白形式存在 ，核酸所處的任何生物環(huán)境都含有蛋白質(zhì)，所以在核酸純化過(guò)程中需使用脫蛋白劑。（如：氯仿、苯酚、SDS、蛋白酶等使蛋白質(zhì)降解或變性，達(dá)到與核酸分離的目的。 DNA和RNA的分離：1、利用DNA和RNA在不同鹽濃度下，溶解度不同進(jìn)行分離（DNA在1-2M時(shí)溶解度大，RNA溶解度小。相反

5、，RNA在低鹽濃度0.14M時(shí)溶解度大，DNA小。）2、通過(guò)使用DNA或RNA酶，達(dá)到DNA和RNA分離的目的。3、根據(jù)分子量不同，進(jìn)行梯度離心，進(jìn)行分離。 核酸的收集： 多用乙醇、異丙醇,質(zhì)粒DNA純化,細(xì)菌培養(yǎng) 從LB瓊脂扳上挑取一個(gè)單菌落。 接種到含有適當(dāng)抗生素的20ml液體LB中。 37搖床培養(yǎng)過(guò)夜（OD 0.6）。 將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入500ml含抗生素的液體LB培養(yǎng)基中。 37 300rpm 約34hr（OD =0.4）。 加入2.5ml 氯霉素（34mg/ml溶于乙醇） ，使終濃度為170ug/ml。 300rpm 37 繼續(xù)培養(yǎng) 1216hr。 離心 4 4000rpm 15min

6、。 棄上清。 將細(xì)菌沉淀重懸于100ml預(yù)冷的STE中。 離心 4 4000rpm 15min。 棄上清，收集細(xì)菌細(xì)胞。,LB培養(yǎng)基 Trypone 10g Yeast extract 5g NaCl 10g 加水至1L STE： 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.CL（PH8） 1mmol/L EDTA（PH8）,1、酚提取法：,將收獲的細(xì)胞重懸在20ml含20蔗糖的TES中。 加入新鮮配制的溶菌酶到終濃度為1mg/ml（枯草桿菌和大腸桿菌）或5mg/ml（蘇蕓金桿菌）。 37保溫3090分鐘，原生質(zhì)游離出來(lái)。 向原生質(zhì)溶液中加8SDS20ml和5M NaCl 10ml

7、。 68保溫5min。 將溶液儲(chǔ)于4冰箱，8hr以上或過(guò)夜。 取出后，立即在4離心18000rpm, 30min。 取上清。 向上清中加入等體積的重蒸酚（PH67），輕搖。,置冰箱15min，離心取水相。 重復(fù)一次。 再用等體積的氯仿異戊醇（24：1）抽提12次。 離心取水相。 加入等體積的乙醚抽提12次。 向水相加兩倍體積95冷乙醇。 20過(guò)夜或70半小時(shí)。 離心15000rpm, 20min, 沉淀DNA。 75的乙醇洗滌一次，室溫或真空干燥。 沉淀溶于PH8的TE緩沖液中。,2、堿裂解法,將細(xì)菌沉淀重懸于10ml Slution 1中。 加入1ml新配制的溶菌酶。 加入20ml新配制Sl

8、ution 2，充分混勻。 放置510min (0)。 加入15ml預(yù)冷的Slution 3 混勻 置冰上10min 離心，4，10000rpm/min, 15min 取上清并加入0.6倍體積的異丙醇充分混勻 室溫放置10分鐘 離心，室溫5000rpm, 15min 棄上清，用70乙醇洗滌 棄乙醇，干燥。 用3ml TE(PH8)溶解核酸沉淀 可用氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心或聚乙二醇沉淀繼續(xù)純化,Slution I 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L TrisCl(PH8) 10mmol/L EDTA(PH8) Slution2 0.2mol/L NaOH(用時(shí)用 10mol/L儲(chǔ)存液

9、稀釋) 1SDS Slution3 5mol/L乙酸鉀60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml,3、煮沸裂解法：,將細(xì)菌沉淀物重懸于預(yù)冷的10ml STET中 加入1ml(10mg/ml,溶于10mmol/L Tris,PH8)新配制的溶菌酶 室溫下放置10分鐘 明火加熱至沸騰，并不停搖晃 立即將其浸入沸水中40秒 再將其浸入冰水中5分鐘 離心，4 15000rpm,30min 取上清，用乙醇或異丙醇沉淀 可繼續(xù)用氯化銫溴化乙錠梯度離心純化,STET 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(PH8) 1mmol/L EDTA(PH8) 5TritonX100,4、

10、SDS裂解法：,將細(xì)菌沉淀物重懸于10ml，預(yù)冷的10蔗糖，50mmol/L Tris.Cl(PH8)溶液中 加入新配制的溶菌酶溶液 加入8ml 0.25mol/L EDTA(PH8)溶液，搖勻。 置冰上10分鐘 加4ml 10% SDS,馬上用玻璃棒迅速混勻內(nèi)容物。 立即加入6ml 5mol/L NaCl(使終濃度為1M混勻。 置冰上 1hr 離心 15000rpm, 30min 取上清 酚：氯仿和氯仿各抽提一次 取水相，并加兩倍體積乙醇，混勻。 放置室溫下12小時(shí) 離心，4 5000rpm 20min。 棄上清，用70乙醇洗滌 離心，4 5000rpm 20min，取沉淀。 用3ml TE

11、(PH8) 溶解DNA 可用氯化銫溴化乙錠梯度離心繼續(xù)純化,DNA繼續(xù)純化,聚乙二醇沉淀法純化DNA： 取3ml 溶于TE中的核酸溶液，加入3ml 預(yù)冷5mol/L LiCl溶液，充分混勻。 離心，4 10000rpm 10min 取上清并加入等體積的異丙醇，混勻。 離心，室溫，10000rpm 10min 棄上清，用70乙醇洗滌沉淀 保留沉淀并用500ul含胰RNA酶（20ug/ml）的TE（PH8溶解沉淀。 室溫放置半小時(shí) 加入500ul含13（W/V）聚乙二醇的1.6mol/LNaCl，充分混勻。,離心，4 12000rpm 5min 去上清，保留沉 加入400ul TE(PH8)溶解沉

12、淀 用酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次 取水相并加入100ul 10ml/L乙酸銨 混勻，并加入兩倍體積乙醇 室溫放置10min 離心，4 12000rpm 5min回收沉淀 加入200ul 4的70乙醇，混勻。 棄上清，等乙醇蒸發(fā)殆盡 500ul TE（PH8溶解沉淀 儲(chǔ)存DNA于20或70,DNA繼續(xù)純化,1、氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)DNA（連續(xù)梯度離心法 精確測(cè)量DNA溶液的體積 按1g/ml的用量加入固體CsCl 加熱至30并溫和混勻。 每10ml DNA溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水 立即將其于DNA氯化銫溶液混勻 離心，室溫8000rpm 5min 將

13、下層清亮紅色溶液轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾x心管中 用輕石蠟油加滿，并封口。 離心，20 45000rpm 16hr 結(jié)果,DNA繼續(xù)純化,收集閉環(huán)DNA 從DNA中除去溴化乙錠 2、不連續(xù)梯度離心： 此方法是將不同濃度的CsCl溶液分層加到離心管中， 這樣可加速CsCl梯度的形成，使離心時(shí)間減少到6hr。,從經(jīng)過(guò)純化的質(zhì)粒DNA中去除溴化乙錠,方法1：有機(jī)溶劑抽提 將DNA溶液放入試管中 加等體積的飽和1丁醇或異戊醇 振蕩混勻兩相 離心，室溫 1500rpm 3min 取水相 反復(fù)抽提46次直到粉紅色從水相中和有機(jī)相中消失。,從經(jīng)過(guò)純化的質(zhì)粒DNA中去除溴化乙錠,方法2： 離子交換層析 如圖所示，用吸管裝

14、一支Dowex AG50樹(shù)脂的柱子（裝柱前需將樹(shù)脂進(jìn)行平衡）。 平衡方法如下： 1、適量Dowex AG50樹(shù)脂溶于100ml 1mol/L NaOH中，攪拌5分鐘，待樹(shù)脂沉淀后，吸出上清棄去。 2、加100ml 1mol/L HCl，繼續(xù)攪拌5分鐘，樹(shù)脂沉淀后，吸出上清棄去。 3、用水重復(fù)步驟兩次（每次100ml），然后用TEN緩沖液（100ml）重復(fù)步驟2一次。 TEN緩沖液： （0.1mol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.01mol/L EDTA(pH8.0)，1 mol/L NaCl） 4、于4將樹(shù)脂儲(chǔ)存于含0.2%疊氮鈉的TEN緩沖液中。 吸去樹(shù)脂上的緩沖液，用2倍體積的TE

15、（Ph8.0）洗柱，將含有溴化乙錠和氯化銫的DNA直接加到樹(shù)脂上。 收集流出物，當(dāng)所有DNA溶液進(jìn)入柱子后，用1.2倍柱體積洗脫，同時(shí)繼續(xù)收集流出物。,柱子流干后，將收集的流出物用2倍體積的水稀釋。 用6倍體積的乙醇，于4下，沉淀DNA 15分鐘。 4，1200轉(zhuǎn)/分 離心15分鐘，收集DNA沉淀。 用4的70%乙醇洗沉淀，按上步重新離心，取沉淀。 用適量TE（pH8.0）溶解DNA。,RNA純化中很重要的一個(gè)任務(wù)是：嚴(yán)格控制RNA酶的活性！,因?yàn)?，所有的組織、人的手指、試劑、容器等中均存在或被污染RNA酶，所以，在對(duì)RNA純化前，需做大量的準(zhǔn)備工作。 常使用的RNA酶的抑制劑： （1） 焦碳

16、酸二乙酯（DEPC）：它是RNA酶的化學(xué)修飾試劑。它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活。 （2） 異硫氰酸胍（GITC）：目前認(rèn)為是制備RNA最有效的抑制劑。它除了對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用外，還具有使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，核酸從核蛋白中解離的作用。 （3） 釩氧核苷酸復(fù)合物：是氧化釩離子和任何核苷形成的復(fù)合物?？膳cRNA酶結(jié)合，而 抑制酶活。 （4） RNA酶抑制蛋白：是一種對(duì)RNA酶有抑制作用的蛋白質(zhì)。 其它如肝素、DTT、SDS等都是RNA酶的抑制劑，在RNA提純中經(jīng)常使用,動(dòng)物組織總RNA的制備,一、 試劑： 變性液（儲(chǔ)存于棕色瓶中）：配制體積：52.8ml,以上混合液可放置室溫

17、下3個(gè)月。用前加入0.36ml 巰基乙醇。加入巰基乙醇后，室溫下可使用1個(gè)月。 其于常規(guī)試劑配制不列舉。,方法 ：,殺死小鼠，放血。 迅速取出所需組織（按所需而定） 用DEPC-ddH2O清洗一下，立即仍到液氮中。 取4-5ml變性液入一洗凈的研缽中備用 從液氮中取出凍好的組織放入一不銹鋼 研缽中，倒入一些液氮，將其碾碎。（在此過(guò)程中，需保證組織不解凍）也可在有變性液存在下用組織勻漿機(jī)進(jìn)行破碎。 將已碾成粉末的組織轉(zhuǎn)移至放有變性液的研缽中，迅速研磨并不斷加入液氮， 反復(fù)如此，直至組織完全碾碎。 取數(shù)個(gè)已滅菌的新EP管中，各加入0.5ml 變性液和組織勻漿 每EP管中加入50ul 3.0M Na

18、Ac(pH4.7)混勻（輕彈）。 每EP管中加入500ul 水飽和酚， 加氯仿-異戊醇（49：1），100ul。 旋渦混合器振動(dòng)1分鐘。 冰浴 15分鐘。 12000轉(zhuǎn)/分，4 20分鐘。 轉(zhuǎn)移上層水相至另一EP管中。,加等體積預(yù)冷的異丙醇 0/N（-20）。 離心，12000轉(zhuǎn)/分，20分鐘。 棄上清，沉淀溶于200ul 變性液中。 加入10.8ul 3M NaAc(pH4.5) 加等體積水飽和酚及1/5體積的氯仿-異戊醇混合物 旋渦混合1分鐘，冰浴20分鐘。 離心 12000轉(zhuǎn)/分，4 20分鐘。 轉(zhuǎn)移水相至另一EP管中，加等體積異丙醇。 -20 1小時(shí)。 離心12000轉(zhuǎn)/分，4 20分鐘 棄上清，沉淀加120ul變性液Vortex 溶解 加等體積冷異丙醇，-20 1小時(shí)。 離心12000轉(zhuǎn)/分，4 20分鐘 棄上清，沉淀用75%乙醇懸浮 離心12000轉(zhuǎn)/分，4 10分鐘 棄上清，室溫或真空干燥。 用DEPC-ddH2O溶解RNA （檢查RNA制備質(zhì)量，測(cè)OD260/OD280 用1-2ul樣品電泳觀察。）,在含有甲醛的凝膠中，進(jìn)行RNA電泳是目前常用的方法。,甲醛凝膠電泳緩沖液： 20*硼酸緩沖液（pH8.3） 5*MOPS緩沖液(避光保存) 0.4M 硼酸 0.1mol/L MOPS(pH7) 10mM EDTA 40mmol/L 乙酸鈉 5mmo