1、第四章,蛋白質(zhì)的化學(xué),預(yù)習(xí)重點(diǎn)： 1.蛋白質(zhì)的功能 2.氨基酸組成、分類、兩性解離 3.氨基酸的分離分析 4.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、肽鍵和肽鏈 5.維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵 6.蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 7.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 學(xué)習(xí)難點(diǎn) ： 1.谷胱甘肽 2.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 3.基序、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu) 4.蛋白質(zhì)合成基本原理 5.蛋白質(zhì)的性質(zhì) 6.蛋白質(zhì)分離純化 7.蛋白質(zhì)純度鑒定,第一節(jié),蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),一、蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的基本成分,二、蛋白質(zhì)具有多樣性的生物學(xué)功能,生物催化作用（酶） 代謝調(diào)節(jié)作用（激素） 免疫保護(hù)作用 （抗體） 轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存作用（血紅蛋白) 運(yùn)動(dòng)與支持作用（肌動(dòng)蛋白、

2、膠原蛋白） 控制生長(zhǎng)和分化作用（核蛋白） 接受和傳遞信息作用（受體蛋白） 生物膜的功能,第二節(jié),蛋白質(zhì)的化學(xué)組成,各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16。,100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 ( g% ) =每克樣品含氮克數(shù) 6.25100,凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量:,定氮儀,一.蛋白質(zhì)的元素組成：,二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位氨基酸,組成蛋白質(zhì)的氨基酸共有20種，稱為基本氨基酸。,（一）基本氨基酸的結(jié)構(gòu)通式,不同的-氨基酸，其R 側(cè)鏈不同,除甘氨酸、脯氨酸外，基本氨基酸皆為L(zhǎng)-氨基酸。,20種氨基酸的分類：根據(jù)R基不同，分為4類,（三）、氨基酸的化學(xué)性質(zhì),兩性解離與等電點(diǎn) 紫外吸收性質(zhì) 茚三酮反應(yīng),.兩性

3、解離,氨基酸在水溶液和晶體狀態(tài)主要以兼性離子形式存在,等電點(diǎn)的定義：當(dāng)溶液處于某一pH值時(shí)，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數(shù)目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點(diǎn)，簡(jiǎn)稱pI。,每種氨基酸都有特定的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸的溶解度最小。,等電點(diǎn),在酸性溶液中 （pH pI）,在水溶液中 （pH=pI）,在堿性溶液中 （pHpI）,溶液pH影響氨基酸的羧基與氨基的解離程度,K1,C,O,O,H,2,N,CH3,K2,Ala+,Ala ,Ala,H,C,Asp+,Asp ,Asp ,Asp =,C,C,CH2,N +,3,H,O,O,H,舉例：,.紫外吸收,在紫外區(qū)酪氨酸、

4、苯丙氨酸和色氨酸有吸光能力。 苯丙氨酸的max259nm 酪氨酸的max278nm 色氨酸的max279nm,蛋白質(zhì)中含有這些芳香族氨基酸，所以也有紫外吸收能力。一般用紫外分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)下測(cè)定最大光吸收，而測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。,.茚三酮的反應(yīng),A.該反應(yīng)非常靈敏， 測(cè)定范圍：0.550g/ml B. 氨基酸與茚三酮，生成的藍(lán)紫色化合物，在570nm測(cè)定吸光值 C.脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮生成黃色物質(zhì)，在440nm處測(cè)吸光值 應(yīng)用： A.氨基酸定量分析（紙層析法或者薄膜層析法分離） B.氨基酸自動(dòng)分析儀,氨基酸的分離與分析,自動(dòng)氨基酸分析儀 1.蛋白質(zhì)完全酸水解 2.水解液于PH 2上

5、樣于鈉型陽(yáng)離子交換柱 3.用PH 3.5 0.2mol/L檸檬酸鈉溶液洗脫 4.用PH 4.25 0.2mol/L檸檬酸鈉溶液洗脫 5.分析洗脫譜上各峰的位置和面積，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜比較分析 P66,第三節(jié),蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),一級(jí)結(jié)構(gòu)（決定空間結(jié)構(gòu)）：又叫共價(jià)結(jié)構(gòu)或基本結(jié)構(gòu)，指蛋白質(zhì)中不同氨基酸的種類、數(shù)量和排列順序。,基序 結(jié)構(gòu)域,（決定功能）,+,NH2-CH-C,R1,O,OH,肽鍵,由一分子氨基酸的羧基和另一分子氨基酸氨基縮合脫水而成。,概念：肽、 二肽、寡肽、多肽、多肽鏈,氨基酸殘基: 多肽鏈中的氨基酸參與肽鏈的形成，已非原來完整的分子，稱為氨基酸殘基。 共價(jià)主鏈：多肽鏈中的骨干是由

6、氨基酸的羧基與氨基形成的肽鏈部分規(guī)則的重復(fù)排列而成，稱為共價(jià)主鏈。 側(cè)鏈：多肽鏈中R基部分，稱為側(cè)鏈。,方向性：,書寫方式：,N端寫在左邊，C端寫在右邊,命名：,從N端到C端,N 末端：多肽鏈中有自由氨基的一端 C 末端：多肽鏈中有自由羧基的一端,一級(jí)結(jié)構(gòu)中化學(xué)鍵：肽鍵（主要）、二硫鍵（少量） 二硫鍵：由兩分子半胱氨酸殘基的巰基脫氫而成，存在于肽鏈內(nèi)或肽鏈間,GSH過氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,生物活性肽,1. 谷胱甘肽(GSH),體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽,2. 多肽類激素,二.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 1.氨基酸組成的分析 蛋白質(zhì)樣品的純化 蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目的測(cè)定

7、 氨基酸組成的分析： 氨基酸自動(dòng)分析儀 含多個(gè)亞基的蛋白質(zhì)，先純化為單 個(gè)亞基，再測(cè)定每個(gè)亞基氨基酸組成,分析肽鏈的N-末端氨基酸 分析肽鏈的C-末端氨基酸,N末端氨基酸分析,A.二硝基氟苯（DNFB）法：P70 B.二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）靈敏度：110-9mol。,C.Edman法（苯異硫氰酸，PITC法）：P71，蛋白質(zhì)自動(dòng)分析儀 D.氨肽酶法：肽鏈外切酶，從多肽鏈的N-端逐個(gè)水解氨基酸。,A.肼解法:,C末端氨基酸分析,B.羧肽酶法：肽鏈外切酶，從多肽鏈的C-端逐個(gè)水解氨基酸。,大分子多肽氨基酸順序的確定：裂解 A.化學(xué)裂解法：溴化氰裂解法；羥胺NH2OH裂解法 B.酶裂法:

8、胰蛋白酶，胃蛋白酶等,確定肽段在多肽鏈中的次序：重疊法 P72 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。 16肽，端H 端 法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT 法裂解：SEO WTON VERL APS HO 重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS,核糖體,蛋白質(zhì)鏈,5.核酸推導(dǎo)法,二、蛋白質(zhì)的構(gòu)象,蛋白質(zhì)分子中原子和基團(tuán)在三維空間上的排列、分布、及肽鏈走向。又稱為空間結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象等。,蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象包括：蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu),（一）維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵,氫鍵、疏水鍵、鹽鍵、配位鍵、二硫鍵、

9、范德華力,1.氫鍵:由連接在一個(gè)電負(fù)性大的原子上的氫與另一電負(fù)性大的原子相互作用形成；多肽鏈主鏈骨架上羰基氧原子與亞氨基的氫原子間形成氫鍵維持二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要次級(jí)鍵；側(cè)鏈間或主鏈間所生成的氫鍵是維持三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵之一。,2.疏水鍵:兩個(gè)非極性基團(tuán)因避開水相而聚集在一起的作用力，維持蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要次級(jí)鍵。,鹽鍵：蛋白質(zhì)分子中帶正電荷集團(tuán)和負(fù)電荷基團(tuán)之間靜電吸引所形成的化學(xué)鍵。,（二）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),多肽主鏈原子的局部空間排列。即多肽鏈的主鏈骨架中若干肽單位，各自沿一定的軸盤旋或折疊，并以氫鍵為主要次級(jí)鍵形成有規(guī)則的構(gòu)象。,肽單位：肽鍵與相鄰的兩個(gè)碳原子所組成的基團(tuán)，又稱肽平面

10、。,肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)； 肽單位是剛性平面結(jié)構(gòu)，肽單位的6個(gè)原子都位于同一平面上；,肽單位的特點(diǎn)：,-折角,蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的種類：,角蛋白中的-螺旋和二硫鍵,（三）基序,多肽內(nèi)順序上相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)聚集體。,超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本形式：,螺旋組合（） 折疊組合（） 螺旋折疊組合（）,（四）結(jié)構(gòu)域,在較大的蛋白質(zhì)分子中，由于多肽鏈上相鄰的超二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系，進(jìn)一步折疊形成一個(gè)或多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的致密的三維實(shí)體。,免疫球蛋白G的立體結(jié)構(gòu),（五）蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),一條多肽鏈中所有原子或基團(tuán)在三維空間的整體排布。,主要化學(xué)鍵：,疏水鍵、 氫鍵

11、、 鹽鍵,（五）蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu),由兩個(gè)或兩個(gè)以上的多肽鏈之間相互作用，彼此以非共價(jià)鍵相連而形成更復(fù)雜的構(gòu)象，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。每一條多肽鏈都有完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)，這每條多肽鏈稱為蛋白質(zhì)的一個(gè)亞基。,主要化學(xué)鍵：,疏水鍵、氫鍵、范德華力、鹽鍵、二硫鍵,血紅蛋白的一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu),（一）肽的人工合成 保護(hù)（氨基、羧基、側(cè)鏈活性基團(tuán)） 活化（氨基、羧基） 縮合劑 （二）胰島素的人工合成（三）固相肽合成,五、肽與蛋白質(zhì)的人工合成,第四節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)是形成空間結(jié)構(gòu)的物質(zhì)基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)分子特定的天然構(gòu)象是蛋白質(zhì)生物功能的體現(xiàn)。,一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,加壓素,H

12、2N- 半胱 酪- 苯丙- 谷胺 天胺 半胱-脯- 精-甘-CO-NH2,縮宮素,H2N- 半胱 酪- 亮- 谷胺 天胺 半胱-脯- 異亮-甘-CO-NH2,一級(jí)結(jié)構(gòu)中關(guān)健部分相同，其功能相同,ACTH,人,豬,牛,一級(jí)結(jié)構(gòu)關(guān)鍵部分的變化，其生物活性也改變,多肽或蛋白質(zhì) 氨基酸位置 相對(duì)活性,腦啡肽（5肽） 衍生物,甘2 蛋5 D-丙 蛋-CO-NH2,1 10,P84,一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與疾病的關(guān)系,例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血,這種由遺傳物質(zhì)DNA突變引起的、在分子水平上僅存在微觀差異而導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。,鐮刀形紅細(xì)胞,正常紅細(xì)胞與鐮刀形紅細(xì)胞的掃描電鏡圖,正常紅細(xì)胞,二、蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象與

13、功能的關(guān)系,1.蛋白質(zhì)前體活化 P85 2.蛋白質(zhì)變構(gòu) 3.蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病,當(dāng)配體與亞基（蛋白）結(jié)合后，引起該亞基構(gòu)象變化，稱為變構(gòu)效應(yīng)。,2、蛋白質(zhì)變構(gòu)效應(yīng),3.蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病,因蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或折疊導(dǎo)致構(gòu)象異常變化引起的疾病，稱為蛋白質(zhì)構(gòu)象病。,瘋牛病是由朊病毒蛋白( PrP)引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。,不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目,生物 AA差異數(shù)目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、豬、羊、狗 11 馬 12 雞、火雞 13 響尾蛇 14 海龜 15 金槍魚 21 角餃 23 小蠅 25 蛾 31 小麥 35 粗早鏈孢霉 43 酵母 44,三、

14、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化,第五節(jié),蛋白質(zhì)的性質(zhì),一、蛋白質(zhì)分子的大小、形狀及分子量的測(cè)定,分子量10000 蛋白質(zhì)； 10000 多肽 P87 胰島素分子量為5437，習(xí)慣上稱為蛋白質(zhì),形狀：根據(jù)其不對(duì)稱常數(shù)，將蛋白質(zhì)分為球形、橢圓 形、纖維狀,分子量測(cè)定常用方法： 分子篩層析法 SDS-聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE） 生物質(zhì)譜,.分子篩層析法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量大小,凝膠顆粒,收集蛋白質(zhì)管,蛋白質(zhì)混合物,大分子,從柱上面加緩沖溶液,小分子,洗脫體積（Ve）,凝膠柱,大分子,小分子,Ve1,Ve2,V0,. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量大小,3.生物質(zhì)譜（MS）測(cè)定蛋白質(zhì)分子量大小

15、,二、蛋白質(zhì)的變性,某些理化因素使蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變或破壞，導(dǎo)致其生物活性的喪失和一些理化性質(zhì)的改變的現(xiàn)象。,變性作用的因素,物理因素：高溫、紫外線、X-射線、超聲波、劇烈振蕩等,化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、去污劑、重金屬、三氯醋酸、濃酒精等,變性作用的意義,變性的特征：,生物活性的喪失,某些理化因素 的改變,溶解度降低，易沉淀 不對(duì)稱性增加 粘度增加 擴(kuò)散系數(shù)降低 分子結(jié)構(gòu)松散，易被水解,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 -巰基乙醇,去除尿素、 -巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,三、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn),蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。,等電點(diǎn)（pI） 在某一p

16、H的溶液中，蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH值稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。,pH=pI,pHpI,pHpI,蛋白質(zhì)的兼性離子,陽(yáng)離子,陰離子,R,CH,四.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),水化膜,水化膜,蛋白質(zhì)形成親水膠體的因素： 蛋白質(zhì)表面有水化層 蛋白質(zhì)表面具有同種電荷,五、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng) 蛋白質(zhì)分子從溶液中析出的現(xiàn)象，稱為蛋白 質(zhì)的沉淀。 1.中性鹽沉淀：硫酸銨、氯化鈉 2.有機(jī)溶劑沉淀反應(yīng)：乙醇、苯酚 3.加熱沉淀反應(yīng)： 4.重金屬鹽沉淀反應(yīng)：重金屬中毒 5.生物堿試劑：藥檢（三氯醋酸）,六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) P93,1.茚三酮反應(yīng)：氨基 2.雙縮脲反應(yīng)：肽鍵 3.酚試劑反應(yīng)：酪氨酸、

17、 色氨酸,七、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì),1.抗原，抗原性 2.抗體 單克隆抗體 多克隆抗體 3.蛋白質(zhì)免疫性質(zhì)的應(yīng)用 免疫預(yù)防：疫苗 免疫、診斷治療,二、蛋白質(zhì)的分離與純化,利用不同蛋白質(zhì)溶解度不同、分子大小不同、電離性質(zhì)不同、配基特異性不同確定使用不同的純化方法,（一）利用溶解度不同的分離純化方法,1.等電點(diǎn)沉淀 2.鹽析沉淀 3.低溫有機(jī)溶劑沉淀法 4.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響,0-40之間，大部分蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增加，40-50以上開始變性而沉淀。因此蛋白質(zhì)分離一般在0或更低的溫度下進(jìn)行。,超過濾,加壓,蛋白質(zhì)溶液,半透膜,支持膜的柵板,超濾液,透析,（二）根據(jù)分子大小不同的分離純化方

18、法,1.透析和超過濾 2.凝膠過濾 3.密度梯度離心,2.分子排阻層析,未知,logMr,洗出液中的蛋白質(zhì)濃度,洗脫體積（mL）,層析的主要設(shè)備,3.密度梯度離心法,滴加樣品,蔗糖密度梯度,蔗糖濃度,CsCl密度梯度離心,（三）根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法,1.電泳法：帶點(diǎn)質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向電荷相反的方向移動(dòng)。 醋酸纖維膜電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 等電聚焦電泳 免疫電泳 二維電泳 2.離子交換層析：離子交換纖維素、 離子交換凝膠、 大孔型離子交換樹脂,等電聚焦電泳,2.離子交換層析分離蛋白質(zhì),NaCl梯度,（五）利用配體的特異性親和力的純化方法,應(yīng)用 分離純化酶、 抗原、抗體 分離純化核酸 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能,a. 理論依據(jù)：待純化分子和配體間具有親和性,基質(zhì) 纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、 sephar