1、植物DNA的提取及凝膠電泳分析,學(xué)生：潘園園 指導(dǎo)老師：王慧中 應(yīng)奇才,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解真核生物基因組DNA提取的原理。 掌握CTAB法提取植物基因組DNA及瓊脂糖凝膠電泳的方法。,1、植物DNA提取 非離子型去污劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）可以溶解細(xì)胞膜，并能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3mol/L NaCl)時(shí)，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB-核酸復(fù)合物與蛋白以及多糖類物質(zhì)分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，使之形成纖維狀絮團(tuán)，CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去，離心沉淀收集得到DNA。,實(shí)驗(yàn)原理,實(shí)驗(yàn)原理,

2、2、凝膠電泳分析 瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠是分離和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。 聚丙烯酰胺凝膠電泳適用于分離小分子的核酸；瓊脂糖凝膠孔徑較大，應(yīng)用于大分子核酸的分離和純化，分離大小范圍在0.2-50kb的DNA片段。 用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶（ethidium bromide ,EB）染色，溴化乙錠嵌入堿基對(duì)之間形成熒光絡(luò)合物，在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。,實(shí)驗(yàn)原理,在紫外光下至少可以檢測(cè)出110ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。 在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對(duì)數(shù)成反比。觀察其遷移距離，與標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行對(duì)照，就可獲知該樣品分子

3、量大小。,實(shí)驗(yàn)材料和試劑,實(shí)驗(yàn)材料 新鮮煙草葉片 實(shí)驗(yàn)試劑 2CTAB緩沖液 氯仿/異戊醇（24：1） 液氮 70%乙醇 異丙醇 TAE緩沖液 6DNA凝膠上樣緩沖液 瓊脂糖 溴化乙錠（EB） 標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA,實(shí)驗(yàn)步驟,CTAB法提取植物總DNA 1、取2cm新鮮煙草葉片于研缽中，加入液氮研磨，研磨成碎粉狀。 2、迅速轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中,加入了600 l 2CTAB提取液（65預(yù)熱） ，緩慢振蕩30s。放入65振蕩水浴鍋中4060 min。 3、加入等體積氯仿/異戊醇，緩慢顛倒混勻至無(wú)明顯分層，室溫靜止12min。室溫下10000r/min離心10min。 4、取500 l上清液，加入

4、2/3體積的異丙醇，緩慢顛倒混勻，絮狀沉淀為DNA，-20放置1h。 5、12000r/min離心10min，去上清，加入200l 70%乙醇洗滌。 6、12000r/min離心5min，去乙醇，風(fēng)干。 7、用30 l TE或者雙蒸水溶解DNA，取5l 電泳，剩余-20保存?zhèn)溆谩?實(shí)驗(yàn)步驟,瓊脂糖凝膠電泳 1、稀釋緩沖液的制備 用50 TAE配置成1 TAE稀釋緩沖液，待用。 2、膠液的制備 稱取1g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入100ml 1TAE，即1%瓊脂糖凝膠。放入微波爐（或電爐）上加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻。 3、膠板的制備 向冷卻至4050的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠（EB

5、）溶液，使其終濃度為0.5g/ml，將凝膠倒入膠槽里，注意不要有氣泡。,實(shí)驗(yàn)步驟,4、加樣 取5 l提取的植物DNA溶液與1l 溴粉藍(lán)液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。 5、電泳 加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源。保持電壓在80110V，電流在40 mA以上。 6.、觀察和拍照 在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下電泳膠，并拍照保存。,注意事項(xiàng),1、液氮研磨時(shí)，應(yīng)當(dāng)快速轉(zhuǎn)移，降低DNA的降解。 2、CTAB裂解液要預(yù)熱，以抑制Dnase，加速蛋白變性，促進(jìn)DNA溶解。 3、各操作步驟要輕柔，盡量減少機(jī)械外力造成DNA降解。 4、取上清時(shí)，不應(yīng)貪多，以防非核酸類成分干擾。 5、異丙醇要預(yù)冷，以減少DNA的降解，促進(jìn)DNA與蛋白等得分相及DNA沉淀。 6、溴化乙錠EB是強(qiáng)誘變劑