1、第六章,微生物生物凈化與環(huán)境再生技術,生物凈化與生物廢料再生,1. 現(xiàn)代生物技術在降解非生物物質中的應用 2. 淀粉和其他含糖廢液的利用 3. 木質纖維的利用 4. 利用微生物生產(chǎn)蛋白質 5. 污水的微生物凈化,5.1 生物凈化的定義,指利用微生物或者其它生物來除去環(huán)境中的生物垃圾和有毒物質的過程。,垃圾中含有很多有用物質，它們可以循環(huán)利用。,生物垃圾主要包括工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的廢棄物。,有毒廢棄物給人們所造成的環(huán)境問題是觸目驚心的,1985 全世界產(chǎn)生有毒廢物五氯酚達50000噸。 1995 海上有5000噸石油原油泄漏。,傳統(tǒng)處理垃圾及有毒廢物的方法：填埋，焚燒，化學處理。但是填埋、化

2、學處理容易造成土壤、水體二次污染，焚燒產(chǎn)生有毒有害廢氣 后果： 不能真正解決污染問題。,20世紀60年代，發(fā)現(xiàn)一些土壤微生物可以降解非生物物質微生物降解廢物，為人類提供一種安全且成本低廉的清除有毒物質的途徑。,降解廢物的微生物多為假單胞菌,降解機制：多種酶同時作用。 編碼酶的基因： 大多位于細胞大質粒上 有些在染色體上 還有的可能同時存在于質粒與染色體,這類微生物都可將未鹵化的芳香族物質轉化為兒茶酚或原兒茶酸，再經(jīng)一系列氧化分解反應，把它們轉化為乙酰輔酶A和琥珀酸或丙酮酸和乙醛，被生物體降解。 鹵化芳香族化合物的降解速度與其所含的鹵族原子數(shù)目成反比，去鹵化反應由雙加氧酶非選擇性催化，在苯環(huán)上用

3、羥基取代鹵素。 海上浮油的清理是利用微生物降解非生物物質的一個重要方面。,苯甲醛,甲酰犬尿氨酸,兒茶酚和原兒茶酸被轉化成乙酰CoA和琥珀酸的降解途徑,兒茶酚和原兒茶酸被轉化成丙酮酸和乙醛的降解途徑,5.1.1 生物降解途徑的基因工程,1. 轉移質粒：將帶有編碼不同降解途徑酶的基因的質粒導入同一受體菌中，若兩質粒具有同源性，則可能組成一個大的具有多種功能的融合質粒。,例子：1. 20世紀70年代 Chakrabarty等構建的 superbug菌含有多種降解功能。 2. 低溫降解甲苯的嗜冷菌的構建。,Superbug菌的構建示意圖,2、改變基因,研究實例：對pWWO質粒的甲苯/二甲苯代謝途徑的研

4、究 該質粒攜帶的與烷基苯降解相關的活性而受到很大的重視。,通過DNA重組技術、基因突變以及適當?shù)倪x擇過程，可在細菌的有機物降解途徑中加入新的功能，用同樣的方法也可得到能同時分解多種污染物的菌株。,pWWO質粒編碼與“間位開裂”途徑相關的12種不同的基因，同時能使帶有該質粒的假單胞菌具有利用不同的烷基苯作為碳源的能力； 在pWWO中，與甲苯/二甲苯代謝途徑相關的基因處在同一個操作子中，即在Pm啟動子控制下的xyl操作子。Pm啟動子受到xylS基因產(chǎn)物的正調控，xyl基因則可以被多數(shù)甲苯/二甲苯途徑的底物所激活，如苯烷、三甲基苯烷。 帶有pWWO質粒的菌株可以將4-乙基苯分解為4-乙基兒茶酚，后者

5、可以在培養(yǎng)基中積累。4-乙基兒茶酚通過使xylE基因的產(chǎn)物兒茶酚-2,3-雙氧化酶失活，使得4-乙基兒茶酚不能再被進一步降解。 與其它苯烷不同的是，4-乙基苯不能激活xylS蛋白，所以當只有4-乙基苯存在時，該操縱子的Pm啟動子不能被激活。,該質粒用于環(huán)境中烷基苯類物質的降解情況： （1）如果環(huán)境中只存在甲苯/二甲苯類，而不存在 4-乙基苯，則該操縱子可發(fā)揮完全活性而使甲苯/二甲苯完全降解； （2）如果僅存在4-乙基苯，由于Pm啟動子不能被啟動，不能發(fā)生降解； （3）但是，如果環(huán)境中同時存在甲苯/二甲苯/ 4-乙基苯，Pm啟動， 4-乙基苯只能發(fā)生部分降解，形成4-乙基兒茶酚，后者可抑制xyl

6、E基因產(chǎn)物兒茶酚-2,3-雙氧酶的活性，使整條代謝途徑不能全部完成。,pWWO上與甲苯/二甲苯代謝途徑有關的基因,兒茶酚2，3-雙氧酶,問題： 1）怎樣克服4-乙基兒茶酚對其進一步降解 反應的抑制作用？ 2）怎樣用4-乙基苯作為誘導物誘導這個操 作子的轉錄？,構建新的質粒,如何解決兒茶酚2，3-雙氧酶失活問題,以4-乙基苯為唯一碳源，含有卡那霉素和誘變劑硫酸乙酰甲烷的平板,三氯乙烷的降解,三氯乙烷是土壤和地下水中最常見的污染物之一，是一種致癌物，可在環(huán)境中滯留幾年。 惡臭假單胞菌（P. putida）及其他一些能降解甲苯類芳香族化合物的細菌能分解三氯乙烷。 甲苯雙氧化酶必需，該酶需四個基因參與

7、表達。 四個基因連到tac啟動子之后，在tac啟動子作用下經(jīng)ITPG誘導可以在大腸桿菌中表達。 生物降解的活性可通過將特異性的酶轉移至最適宿主而得到提高。,5.1.2 利用微生物降解農(nóng)藥,農(nóng)藥的廣泛使用：,農(nóng)作物產(chǎn)量提高,農(nóng)藥污染越來越嚴重,80農(nóng)藥殘留在土壤中,有機氯殺蟲劑,多種具有農(nóng)藥降解能力的微生物,影響農(nóng)藥降解的因素,農(nóng)藥的化學性質 難度：氯代烴類二硝基苯三甲基取代氧基脂肪酸脂肪酸 環(huán)境濕度 難度：潤濕環(huán)境干燥環(huán)境,化學農(nóng)藥的微生物降解途徑,農(nóng)藥微生物降解的途徑： 1.礦化作用 通過微生物的代謝作用，最終完全降解為CO2和H2O。 2. 共代謝作用 微生物將農(nóng)藥轉化為可代謝的中間產(chǎn)物，

8、從而從環(huán)境中清除殘留的農(nóng)藥。,化學農(nóng)藥的微生物降解結果,1.解毒作用 有毒 無毒 2.結合作用 農(nóng)藥的微生物代謝產(chǎn)物與未被代謝的農(nóng)藥相結合，形成更復雜但是無毒的物質，如形成有機酸等。 3.改變毒性譜 4.活化作用 無毒或低毒 有毒和劇毒 5. 消效作用 潛在的有毒農(nóng)藥 無毒物質,5.1.3 利用綠色植物清除污染物,能量來自太陽，經(jīng)濟。 但見效慢，且所處環(huán)境酸度，鹽度在植物耐受范圍之內(nèi)。,例：,除去土壤中的鎘Cd,Sebertia accuminata可以在體內(nèi)富集鎳（Ni）達干重的25,野生植物在應用中的局限：,2. 具有吸收污染物能力的植物生長緩慢,3. 這類植物多屬于稀有植物，難以獲得，且

9、對這類植物生長發(fā)育特點知之甚少,1. 每種植物只吸收一種污染物,植物消除化學污染的發(fā)展,從植物中篩選突變體。如：一種突變的矮牽牛可吸收比野生型多10100倍的鐵離子； 利用植物基因工程獲得轉基因植物。如：轉金屬硫蛋白基因的植物； 從傳統(tǒng)的消除無機物污染發(fā)展到消除有機物污染：已獲得降解三硝基甲苯(TNT)，三氯乙烷(TCE)的轉基因植物。,5.2 淀粉和其他含糖廢液的利用,制糖工業(yè)和食品加工業(yè)的各種廢渣、廢液中含有淀粉可用來生產(chǎn)細菌蛋白或作為飼料。 制糖工業(yè)產(chǎn)生的廢蜜可用于生產(chǎn)食用或 藥用酵母。 還可用廢液、廢渣生產(chǎn)果糖和乙醇。 還可用廢液、廢渣生產(chǎn)其他種類真菌如白地霉，禾本科鐮孢菌等。,先分解

10、為低分子量的物質。 主要酶：-淀粉酶、葡萄糖化酶、葡萄糖異構酶。 主要步驟： 膠化：通過高壓熏蒸使淀粉轉變成膠狀物質 水解反應：在-淀粉酶的作用下， -1,4-糖苷鍵發(fā)生水解，形成低分子量多糖。一般要求在5060下進行。 糖化：在葡萄糖化酶的作用下，低分子量多糖轉變成葡萄糖，即多糖的完全水解。,5.2.1利用淀粉和其他含糖廢液生產(chǎn)果糖和乙醇的常規(guī)方法,淀粉生產(chǎn)商品果糖和乙醇的過程,淀粉的酶解,淀粉酶隨機水解-1，4糖苷鍵 淀粉酶從末端水解-1，4糖苷鍵 葡萄糖淀粉酶水解-1，3、-1，4和-1，6糖苷鍵,工業(yè)用淀粉酶來源于Bacillus amyloliquefaciens 葡萄糖淀粉酶來源于

11、Aspergillus niger,5.2.2 利用DNA重組技術對果糖和乙醇生產(chǎn)方法進行改進的幾種假設,1. 利用生長在廉價培養(yǎng)基的是重組后的微生物大量生產(chǎn)所需的酶，這比直接從組織中提取成本低。 2. 利用-淀粉酶的突變體進行工業(yè)生產(chǎn)。 3. 改變-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的基因使它們具有同樣的最適溫度和最適PH值。 4. 尋找和利用DNA重組技術獲得能夠分解粗淀粉的酶 5. 尋找一種可發(fā)酵的生物，使之能夠分泌葡萄糖淀粉酶。,5.2.2.1 -淀粉酶基因的改造,結果表明： -淀粉酶是在自身啟動子作用下轉錄的，且該基因上帶有分泌信號,5.2.2.2 木糖/葡萄糖異構酶基因的改造,木糖/葡萄糖異構酶

12、即為葡萄糖異構酶, D-葡萄糖轉化為D-果糖僅為其副反應。 該酶定位于細胞內(nèi)，制備時具有較高的成本。 葡萄糖轉化果糖的異構過程是一可逆反應，溫度越高，果糖含量越高。因此，耐熱的木糖/葡萄糖異構酶具有較大的開發(fā)價值。 嗜熱菌Therrnus thermophilus能產(chǎn)生一種木糖/葡萄糖異構酶,它在高溫下非常穩(wěn)定，但酶產(chǎn)量不高。 已分離該酶基因，分別在大腸桿菌和芽孢桿菌中表達，結果表明，在短桿菌中的酶活是出發(fā)菌的1000多倍；,對酶底物特異性的改進。如定點誘變嗜熱菌Clostridium thermosufurogenes葡萄糖異構酶的兩個AA(139位的Tyr Phe,186位的Val Thr

13、)，提高轉化效率。,5.2.2.3 尋找新的工業(yè)發(fā)酵用菌,目前工業(yè)發(fā)酵乙醇全用酵母。運動發(fā)酵單胞菌（ Zymomonas mobilis ）生成乙醇的速度更快 運動發(fā)酵單胞菌為 G-桿菌，能通過發(fā)酵將葡萄糖、果糖、蔗糖轉化為乙醇，而且產(chǎn)量很高。但是，該菌存在如下一些限制因素： 1、可被利用的碳源物質十分有限； 2、外源載體往往在該菌內(nèi)極不穩(wěn)定； 3、該菌對多種抗生素具有抗性。,5.3 木質纖維的利用,木質纖維經(jīng)化學和生物學處理，可轉化為各種各樣的無污染的工業(yè)原料。,木質纖維分類：,初級纖維：棉花、木材、干草等。 農(nóng)業(yè)廢棄物：稻草，秸稈、甘蔗渣等 日常生活的廢纖維產(chǎn)品：廢紙等,5.3.1 木質纖

14、維的成分,1. 木質素 2. 半纖維素 3. 纖維素,人們已經(jīng)將很多化學和酶學的方法用來處理木質纖維，但迄今為止成功的方法很少。,結構中沒有任何規(guī)則的重復單元或易被水解的鍵,理化性質由合成過程中的最后一步?jīng)Q定，而且是隨機的，造成了其分子的不規(guī)則性,它的存在使植物具有一定硬度，能夠抵抗機械壓力和微生物侵染,半纖維素是由五碳糖和六碳糖組成的短鏈異源多聚體,纖維素,構成植物細胞壁的主要成分,由葡萄糖通過 1，4糖苷鍵連接而成的直鏈多聚物，通常一條鏈中可含10000多個葡萄糖分子。,5.3.2 原核生物中纖維素酶基因的分離,許多細菌和真菌都能在多種酶的共同作用下水解纖維素，這些酶統(tǒng)稱纖維素酶。 纖維素

15、酶是一種被稱為纖維小體的多功能復合蛋白的一部分，位于細胞外表面。,纖維素酶含有下列幾種酶： 葡聚糖內(nèi)切酶：催化-1,4-糖苷鍵的水解 葡聚糖外切酶：從纖維素缺刻部分的非還原末端開始降解 纖維素分子，產(chǎn)物為葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖 纖維素水解酶：從纖維素分子的非還原端切去10個以上的葡萄 糖殘基 -葡萄糖苷酶：將纖維二糖或纖維一糖轉化為葡萄糖,葡萄糖苷酶,野生的微生物降解纖維素速度很慢，人們試圖通過基因工程方法得到具有更高纖維素酶活性的微生物。,采用下列分離方法，人們從原核生物中克隆了編碼葡萄糖內(nèi)切酶的基因。,剛果紅可以選擇性地與高分子纖維素結合并顯示紅色，而與低分子量的多糖的結合能力較弱，顯

16、黃色。,利用上述技術，人們從Streptomyces、Clostridium、Thermoanaerobacter、Cellulomonas、Fibrobacter和Bacillus中成功地分離出了編碼葡聚糖內(nèi)切酶的基因。,免疫學方法篩選帶有重組的葡聚糖內(nèi)切酶基因的克隆。,5.3.3 真核生物纖維素酶基因的分離,差異雜交法,聚丙烯酰胺凝膠,兔網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)和麥胚細胞系統(tǒng),5.3.4 纖維素酶基因的改造,纖維素酶的結構可分3個區(qū)域：催化區(qū)域、富含Pro、Ser、Thr殘基的鉸鏈區(qū)、纖維素結合區(qū)域。 催化和結合區(qū)域可獨立發(fā)揮功能。人們可以僅克隆纖維素結合區(qū)域作為融合蛋白編碼序列的一部分。另一部分基

17、因則編碼商品蛋白。 融合蛋白可以結合在纖維素柱上得到純化。 多數(shù)纖維素酶基因最初都是在大腸桿菌中克隆和表達的。 現(xiàn)在已轉化到釀酒酵母和Zymomonas mobilis中。,工業(yè)上應用微生物由纖維素生產(chǎn)乙醇的方式,直接法： 同一微生物完成纖維素的水解、糖化和乙醇發(fā)酵 熱纖維梭菌：Clostridium thermocellum 副產(chǎn)物較多 間接法： 一種微生物水解纖維素并糖化，另用酵母進行乙醇發(fā)酵 成本較高 同時糖化發(fā)酵法： 利用一種可產(chǎn)生纖維素酶的微生物和酵母在同一容器中連續(xù)進行纖維素的糖化和發(fā)酵,工業(yè)上的兩個難題：,酶的成本較高,前處理成本較高,解決辦法：,1.生物技術對產(chǎn)纖維素酶的微生物

18、進行改造 2.固定化技術 3.改進工藝，減少中間產(chǎn)物對酶的抑制 4.開發(fā)能直接作用于天然高聚合纖維素的微生物,5.4 利用微生物生產(chǎn)單細胞蛋白(SCP),人口急劇增長，食品不足，蛋白質資源短缺； 工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不斷產(chǎn)生大量的有機廢棄物，其中包含著大量糖質、淀粉、纖維素、半纖維素等可再生性生物資源； 利用微生物將廢棄物質轉化為蛋白質，提高資源利用率，消除環(huán)境污染，改善生態(tài)環(huán)境。,5.4.1 微生物蛋白的營養(yǎng)價值,微生物菌體粗蛋白含量（占干重）：細菌 4080、酵母3560、絲狀真菌1550 氨基酸組成：含S氨基酸稍不足外，其他豐富。 含多種維生素，如B2、B6、 胡蘿卜素及麥角固醇等，但B12稍不足

19、。 在所含的礦物質中，磷、鉀豐富，但鈣含量較少。,單細胞蛋白：single cell protein, SCP,是指從純培養(yǎng)的微生物細胞中提取的總蛋白質。 潛在的應用： 作為人類食品； 作為畜用飼料； 作為工業(yè)原料（微生物培養(yǎng)基成分、合成纖維的 親水劑、各種填料、增稠劑、乳化劑及穩(wěn)定劑等）,單細胞蛋白的優(yōu)點： 微生物生長快，蛋白產(chǎn)量高； 0.5 kg牛肉/1000 kg酵母蛋白 單細胞藻類：750噸蛋白質（干重）/年畝， 而大豆：5075噸蛋白質（干重）/年畝， 玉米：1530噸蛋白質（干重）/年畝。 微生物蛋白含量高，氨基酸種類全，且富含維生素； 微生物的培養(yǎng)不受季節(jié)、氣候和地區(qū)的限制，易于

20、實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。 缺陷： SCP中核酸含量高； 毒性物質存在的可能； 人類消化較慢； 目前比其它來源的蛋白（如大豆蛋白）昂貴。,5.4.2 單細胞蛋白的生產(chǎn),單細胞蛋白的生產(chǎn)可通過細菌、酵母、真菌、藻類和放線菌來進行； 德國首先利用酵母來生產(chǎn)用作湯和調味的加厚劑； 1973年，各大石油公司利用石油或者副產(chǎn)品生產(chǎn)SCP，后因成本變高而放棄； 1979年，英國帝國化學公司ICI連續(xù)甲醇發(fā)酵法：利用食甲基嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus）用甲醇作為碳源，建立了50000T年產(chǎn)的工廠，擁有世界上最大的連續(xù)發(fā)酵器，但還是由于成本高而無法大規(guī)模生產(chǎn)。 充分利用多種不同廢物

21、。,選擇菌種的原則：產(chǎn)物蛋白要富于營養(yǎng)、可口、易消化、無毒、微生物易于培養(yǎng)，便于收集。,5.4.3 利用木腐性食用菌生產(chǎn)蛋白,解決人們對單細胞蛋白食用的疑慮。 傳統(tǒng)方式農(nóng)業(yè)式栽培：勞動強度大、難以實現(xiàn)自動化、機械化。 液體深層發(fā)酵法：高效自動化，但難以獲得子實體。 雖然研究測定表明，菌絲體的營養(yǎng)成分與子實體相當，但是菌絲體并不能作為食品來投放到市場，因此還需要經(jīng)過進一步加工成其它形式的食品或者作為食品添加劑才能投放到市場。,5.5 污水的微生物凈化,水是人類賴以生存的最寶貴的資源。 水不是取之不盡、用之不竭的！今天，水資源枯竭、水質惡化是擺在全人類面前的一個嚴重問題。 污水的分類及特點：生活污水， 工業(yè)污水。 不同來源污水降解難易程度不同。,5.5.1 用微生物處理污水的機制,通過微生物的代謝活動，將污水中的有機物分解，從而達到凈化污水的目的。 天然水體的自凈化