1、生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn),南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 張茵 2010.3,實(shí)驗(yàn)二、酵母蔗糖酶的提取和酶活測(cè)定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)提取酵母蔗糖酶和測(cè)定酶活力的方法； 學(xué)習(xí)提取生物活性大分子的方法。,實(shí)驗(yàn)材料,材料：活性干酵母粉、石英砂； 試劑：95冰乙醇、DNS液、PBS（pH7.2）、 5蔗糖溶液、1N NaOH溶液； 儀器：水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、722型分光 光度計(jì)。,實(shí)驗(yàn)原理,蔗糖酶的提取過(guò)程和酶活的測(cè)定方法； 蛋白質(zhì)等生物活性大分子的提取方法。,提取工藝和酶活測(cè)定,蔗糖酶 蔗糖酶的耐熱溫度為50度，45度以下可保持酶活不變；在pH3.08.0范圍內(nèi)均可保持較高的酶活； 蔗糖酶的活性中心有巰基，因此在

2、提取時(shí)應(yīng)防止其被氧化，或者加入還原劑（如Vc）保持酶活力； 酵母細(xì)胞存在兩種蔗糖酶，一種在細(xì)胞壁中，一種在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，前者活力較高，分子量較大（約270KDa），后者活力較低，分子量約為135KDa，兩種酶的底物專一性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)十分相似，因此，本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶。,提取工藝 1. 破碎酵母細(xì)胞的方法： 蔗糖酶分子量較大，一般采用研磨法徹底破碎細(xì)胞使其釋放出來(lái)，但應(yīng)注意研磨過(guò)程中保持低溫防止酶失活； 或者采用自溶法（適當(dāng)?shù)乃岫群蜏囟认吕媒湍妇陨淼拿赶灯茐募?xì)胞壁），此方法較為溫和，但是時(shí)間較長(zhǎng)，需加入少量防腐劑，防止過(guò)程中外界細(xì)菌污染； 原則：低溫，處理時(shí)間短，防止酶失活。,2. 選擇性熱

3、變性： 根據(jù)蔗糖酶的耐熱性質(zhì)，將熱不穩(wěn)定性雜蛋白變性除去， 而蔗糖酶保持活性仍在上清液中；該法簡(jiǎn)便易行。 原則：1、選擇合適的溫度和加熱時(shí)間，防止目的物變性， 2、溶液的蛋白質(zhì)濃度要合適，防止蔗糖酶與雜蛋白共沉淀。 3. 有機(jī)溶劑沉淀法： 根據(jù)蔗糖酶的分子量和親水性，在溶液中加入一定量的無(wú)水乙醇溶 液，利用其脫水作用，破壞了蛋白質(zhì)分子表面的水化膜，使蔗糖酶 聚集沉淀下來(lái)，而與其它雜質(zhì)分開(kāi)。一般采用分級(jí)沉淀法摸索目的 物沉淀的條件。 原則：1、注意在低溫下操作，故無(wú)水乙醇要預(yù)冷； 2、邊加乙醇邊攪拌溶液，防止局部乙醇過(guò)濃，導(dǎo)致酶變性失活； 3、離心后應(yīng)迅速將上清倒出，沉淀物用緩沖液溶解，避免酶與

4、有 機(jī)溶劑長(zhǎng)時(shí)間接觸，防止其變性。,測(cè)定酶活的原理 蔗糖酶可作用于1，2糖苷鍵，將蔗糖水解為D葡萄糖和D果糖； Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活劑，Mn2+ 是其抑制劑。 葡萄糖和果糖具有還原性，在偏堿性條件下，可與3，5二硝基水楊酸共熱后生成棕紅色物質(zhì)，在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度成正比例關(guān)系。 蔗糖酶的活力通過(guò)其水解生成的還原糖量來(lái)反映。,提取酶注意事項(xiàng) 了解目的物的分子量、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，選擇合適的提取條件； 提取過(guò)程中采用緩沖液系統(tǒng)溶解酶，并可添加一些保護(hù)劑（如還原劑、金屬螯合劑等）； 提取過(guò)程一般保持低溫、避免劇烈攪拌、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等變性的因素；

5、一般先選擇分辨率低處理量大的方法（如萃取、沉淀、吸附）濃縮酶，再采用分辨率高的方法（如離子交換層析、親和層析、超濾）精制； 通過(guò)酶活測(cè)定，調(diào)節(jié)提取條件。,實(shí)驗(yàn)步驟,反復(fù)凍融法破碎酵母細(xì)胞 稱取0.5g活性干酵母粉，0.2g石英砂，置于預(yù)冷的研缽中，研磨至粉狀， 加入10mLPBS（pH7.2），混合均勻，研磨5min ,20度冷凍（液面結(jié)一層薄冰即 可），再研磨5min； 離心獲得粗酶液 吸取3mL酵母細(xì)胞破碎液于離心管中（兩組同學(xué)配平），5000rpm 15min，保留上清液；粗酶液 分離純化獲得純酶液 吸取剩余的7mL酵母細(xì)胞破碎液于燒杯中，45度水浴15min，緩慢攪拌（防止產(chǎn)生泡沫，蛋白質(zhì)變性），迅速冷卻， 5000rpm 15min，保留上清液；選擇性熱變性除去雜蛋白 將上清液置于燒杯中，加入等體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇（乙醇終濃度約50），邊加邊緩慢攪拌，20度靜置1520min，5000rpm 15min，保留沉淀物；有機(jī)溶劑沉淀法獲得蔗糖酶 吸取7mLPBS（pH7.2）于沉淀物中，輕輕攪拌促溶；純酶液,酶活測(cè)定 蔗糖酶將底物水解為還原糖,2、DNS法測(cè)定還原糖量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,計(jì)算酶活力 將吸光值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到1.0mL水解液中還原糖量（m） 酶活力（U/mL）m（mg）3.5（水解液總體積）/1.0（吸取酶液體積） 蔗糖酶活力定義：在一定實(shí)驗(yàn)