1、基因工程的基本操作程序,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),調(diào)控遺傳信息表達(dá),上 游有啟動(dòng)子，下游有終止子,啟動(dòng)子,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）,編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn),內(nèi)含子,外顯子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,原核細(xì)胞與真核

2、細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測與鑒定,目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。,基因操作的基本步驟,一、目的基因的獲取 將需要的基因從供體生物的細(xì)胞內(nèi)提取出來。,一、目的基因的獲取,1、目的基因主要是指_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子,2、獲取目的基因的常用方法,（1）從基因文庫中獲取,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,（3）人工合成,(1)從基因文庫中獲取目的基因,什么是基因文庫

3、？ 什么是基因組文庫？ 什么是部分基因文庫？ 怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？ 目的基因的有關(guān)信息與什么相聯(lián)系？,概念：基因文庫 （gene library）,將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(gene library),基因組文庫: 基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫. 部分基因文庫: 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.,基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系,思考：基因文庫如何構(gòu)建？,如果用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 多種互補(bǔ)

4、DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，那么，這個(gè)受體菌群體就構(gòu)成了這種生物的cDNA文庫。這種方法稱反轉(zhuǎn)錄法,cDNA文庫的構(gòu)建,反轉(zhuǎn)錄法：,基因組DNA文庫,cDNA文庫,基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較,（3）如何從基因文庫中得到所需要的基因？,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。,1、構(gòu)建基因組DNA文庫時(shí)，首先應(yīng)分離細(xì)胞的 A、染色體DNA B、線粒體DNA C、總mRNA D、tRNA,2、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是 A、某

5、生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫 B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某個(gè)生物 體內(nèi)，則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫 C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫 D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫,A,C,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。,PCR技術(shù),原理： 前提： 原料 方式,PCR擴(kuò)增儀,DNA復(fù)制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式擴(kuò)增， 即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離

6、子,過程,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA 退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合 延伸：加熱至7075以目的基因?yàn)槟０澹铣苫パa(bǔ)的新DNA鏈,1、在遺傳工程中，若有一個(gè)控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTGTACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時(shí)應(yīng)給予的條件是 雙鏈DNA分子為模板 ATGTG或TACAC模板鏈 四種脫氧核苷酸 四種核苷酸 DNA聚合酶 熱穩(wěn)定DNA聚合酶引物 溫度變化 恒溫 A B C D,D,2、在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌呤脫氧核苷酸是

7、460個(gè)）放入DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4代，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是 A.540個(gè) B.8100個(gè) C.17280個(gè)D.7560個(gè),B,（3） 人工合成,根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,推測,推測,目的基因,化學(xué)合成,1、在已知序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是 A、化學(xué)合成法 B、基因組文庫法 C、cDNA文庫法 D、聚合酶鏈反應(yīng),2、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是 從基因文庫中獲取目的基因 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 反轉(zhuǎn)錄法 通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成 A B C D,A,D,3、

8、目的基因主要是指_的結(jié)構(gòu)基因。獲得目的基因的常見方法有三種：（1）從基因文庫中獲取目的基因，根據(jù)基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_產(chǎn)物mRNA，基因的_產(chǎn)物蛋白質(zhì)等獲取目的基因。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，該技術(shù)是一項(xiàng)在_完成的核酸合成技術(shù)，前提條件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因較小且核苷酸序列已知，可以通過_方法。,編碼蛋白質(zhì),核苷酸,染色體,轉(zhuǎn)錄,表達(dá),體外,核苷酸,引物,人工合成,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心,（1）用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出_。 （2）用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。,（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再

9、加入適量_，形成了一個(gè)重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,1.過程:,質(zhì)粒,目的基因,限制酶處理,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,兩個(gè)切口 獲得目的基因,DNA連接酶,表達(dá)載體,同種,1.過程:,a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代,b、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用,思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？,不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是： （1） 生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的

10、啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)； （2） 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄； （3） 目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記； （4） 為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等； （5） 有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。,3.基因表達(dá)載體的組成：,它們有什么作用？,a、目的基因,b、啟動(dòng)子,c、終止子,d、標(biāo)記基因,位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點(diǎn),位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄,檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,1

11、、（多選）一個(gè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括 A目的基因 B啟動(dòng)子 C終止子 D標(biāo)記基因,ABCD,2、下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是 A啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼 B啟動(dòng)子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用 C標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選 D基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別,A,3、目前轉(zhuǎn)基因工程可以 A. 打破地理隔離但不能突破生殖隔離 B. 打破生殖隔離但不能突破地理隔離 C. 完全突破地理隔離和生殖隔離 D. 部分突破地理隔離和生殖隔離,C,常用的受體細(xì)胞：,有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿

12、菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點(diǎn):,能感染雙子葉植物和祼子植物,對(duì)單子葉植物無感染能力,Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上,轉(zhuǎn)化過程:,Ti質(zhì)粒 目的基因,構(gòu)建,表達(dá)載體,植物細(xì)胞,植物細(xì)胞染色DNA,新性狀,農(nóng)桿菌,（2）基因槍法,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管

13、通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,方法:,顯微注射技術(shù),操作程序:,提純含目的基因表達(dá)載體,取受精卵,顯微注射,移植到子宮,受精卵發(fā)育,新性狀動(dòng)物,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,常用法：Ca2+處理,常用菌：大腸桿菌,微生物作受體細(xì)胞原因： 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,過程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是 A結(jié)構(gòu)簡單、操作方便 B繁殖速度快 C

14、遺傳物質(zhì)含量少、簡單 D性狀穩(wěn)定、變異少 2、基因工程常用的受體細(xì)胞有 大腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動(dòng)植物細(xì)胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 A.人工合成基因 B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D.目的基因的檢測和表達(dá),C,4. 采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是 將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌感

15、染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng) A B C D,C,5. 下列屬于基因工程中導(dǎo)入目的基因方法的是 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管道法 顯微注射法 胚胎移植 DNA分子雜交法 A B C D,C,(四)目的基因的檢測與鑒定,檢測,導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,方法,DNA分子雜交,表達(dá)檢測,轉(zhuǎn)錄檢測分子雜交,翻譯檢測抗原抗體雜交,分子檢測法,鑒定,抗蟲鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等,個(gè)體水平的鑒定,知識(shí)延伸DNA分子雜交技術(shù),該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所

16、要查明的DNA或基因。,返 回,1、用-珠蛋白的DNA探針可以檢測出的遺傳病是 A鐮刀狀細(xì)胞貧血癥 B白血病 C壞血病 D苯丙酮尿癥,A,2、應(yīng)用基因工程技術(shù)診斷疾病的過程中必須使用基因探針才能達(dá)到檢測疾病的目的。這里的基因探針是 A用于檢測疾病的醫(yī)療器械 B用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子 C合成-珠蛋白的DNA D合成苯丙羥化酶的DNA片段,B,思考與探究：,2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個(gè)抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?,要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；要加趨化和誘導(dǎo)的

17、物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。,3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？,有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,4.-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假

18、如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？,（1）從小鼠中克隆出-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA)。 （2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個(gè)表達(dá)載體。 （3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會(huì)不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。 （4）培養(yǎng)進(jìn)入了-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取-珠蛋白。,復(fù)習(xí)題,1）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞有哪些方法?(試舉例說明),2）簡述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來 B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,5）基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是