1、miRNA 靶基因識別和功能調(diào)節(jié),一、mRNA簡介,microRNA（miRNA）是一類能夠調(diào)節(jié)基因表達的短單鏈內(nèi)源非編碼RNA（約22nt），通過與互補的mRNA選擇性地結(jié)合抑制蛋白的產(chǎn)生，廣泛存在于動物、植物、病毒等多種有機體中。miRNA通常位于基因間或者內(nèi)含子區(qū)域，在細胞核內(nèi)有RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有帽子結(jié)構(gòu)多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA。,在核酸酶Drosha及其輔助因子Pasha的作用下，pri-miRNA被處理成70個核苷酸組成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，然后由Exportin5等轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)。Dicer將pre-miRNA切割成約22nt的雙鏈miRNA。,雙鏈miR

2、NA講解形成單鏈的成熟miRNA。成熟miRNA還需要與Argonaute蛋白等組裝形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），RISC作用于特異mRNA的3UTR，從而抑制翻譯過程或者直接降解mRNA。,SiRNA與mRNA比較,SiRNA和mRNA也有區(qū)別。1.根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，在基因組中有固定的基因座位；siRNA可以是人工體外合成的，也可以是基因組的轉(zhuǎn)錄片斷，降解片斷和轉(zhuǎn)座片斷，病毒基因組轉(zhuǎn)錄片斷等，關(guān)鍵在于siRNA沒有固定的基因座位，本身不是基因組的功能片斷，是隨機產(chǎn)生的，即加工位點不是保守的。2.二者結(jié)構(gòu)上沒有本質(zhì)區(qū)別，功能分子都是單鏈RNA，miRNA轉(zhuǎn)錄出來時必然是發(fā)夾

3、狀的，siRNA可以由完全互補的雙鏈切斷而來，也可以從發(fā)夾來。,二、靶基因預(yù)測方法,盡管對miRNA功能的認識還不是非常清楚，但miRNA在許多生物過程中起關(guān)鍵作用，包括發(fā)育、細胞分化、增殖、凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移等。準確快速地預(yù)測miRNA靶基因?qū)τ谘衜iRNA功能以及分析miRNA參與的生物學(xué)過程具有十分重要的意義。目前尋找miRNA靶基因的方法主要有生物信息學(xué)以及生物實驗方法。,1、生物信息學(xué)方法,生物信息學(xué)方法主要是利用某種算法對靶基因樣本進行評分及篩選。生物信息學(xué)的方法只是通過算法為研究人員提供可能性最大的參考信息，還需要通過實驗進行驗證。,目前常規(guī)的算法主要遵循以下幾個常用原則：（a）mi

4、RNA與靶基因的互補性；（b）miRNA靶位點在不同物種之間的保守性；（c）miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性；（d）miRNA靶位點不會有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)；（e）miRNA5端于靶基因的結(jié)合能力強于3端。除了這些基本原則以外，不同的預(yù)測方法還會根據(jù)各自總結(jié)的規(guī)律對算法進行限制和優(yōu)化。,使用計算機預(yù)測植物miRNA靶基因比較簡單，因為在植物中miRNA與靶基因幾乎還是以完全互補配對的方式結(jié)合，預(yù)測不需要復(fù)雜的算法。而預(yù)測動物miRNA靶基因則存在一定的困難，主要是目前已知的miRNA靶基因及其確切靶點不多，在算法編寫時沒有足夠的已知樣本可供參考。但是，miRNA與靶基因間的相互作用仍然具有一

5、定的規(guī)律性。,各不同算法各有其特點，主要還是依據(jù)miRNA與其靶位點的互補性、miRNA靶位點的保守性、miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性及附近序列的二級結(jié)構(gòu)等原則設(shè)計的。其中，miRanda是將miRNA-mRNA之間的序列匹配，保守性及熱穩(wěn)定性作為計算參數(shù)，有比較好的檢出率，但是假陽性率也較高；TargetScan提出了“種子區(qū)”的概念，增加了預(yù)測的精確度。,2、生物學(xué)實驗方法,(1)從mRNA水平尋找miRNA靶基因 將miRNA成熟體雙鏈或腺病毒載體轉(zhuǎn)染至細胞中，使得miRNA在細胞中過表達，之后利用基因芯片分析mRNA的變化以找出相應(yīng)miRNA的靶基因9。由于miRNA在體內(nèi)通過

6、翻譯抑制或影響mRNA的穩(wěn)定性起作用，因此這種方法在尋找起翻譯抑制作用的miRNA的靶基因時存在一定困難。,（2）從蛋白質(zhì)水平尋找miRNA靶基因 由于miRNA所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制過程不引起mRNA水平的改變，因此依據(jù)mRNA水平的變化尋找miRNA靶基因的方法在檢出率上存在一定問題。Selbach13和Baek14兩個研究組分別利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，建立了從蛋白質(zhì)水平尋找miRNA靶基因的新方法。,此外，目前最為常用的miRNA靶位點鑒定方法是熒光素酶報告基因法。其基本原理是首先構(gòu)建熒光素酶表達載體，將希望鑒定的miRNA靶基因的3UTR構(gòu)建到熒光素酶基因的3UTR中；之后將構(gòu)建好的

7、載體轉(zhuǎn)染細胞并改變細胞中相應(yīng)miRNA的表達水平；最后檢測熒光素酶的表達情況，以分析轉(zhuǎn)染3UTR中是否含有miRNA的靶位點1,15。,三、功能調(diào)控,與靶mRNA不完全互補的miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達（哺乳動物中比較普遍）。然而有證據(jù)表明，這些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性。使用這種機制的miRNA結(jié)合位點通常在mRNA的3端非編碼區(qū)。如果miRNA與靶位點完全互補（或者幾乎完全互補），那么這些miRNA的結(jié)合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比較常見)。,通過這種機制作用的miRNAs的結(jié)合位點通常都在mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框中。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調(diào)控某個基因的表達。隨著miRNA調(diào)控基因表達的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。,四、mRNA調(diào)控特點,廣泛存在于真核生物中, 是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA , 它本身不具有開放閱讀框架(ORF) ; 70 %的哺乳動物miRNA 基因是位于TUs區(qū) 通常的長度為1825 nt , 但在3端可以有12 個堿基的長度變化; 成熟的miRNA 5端有一磷酸基團, 3