1、第一篇 造血細胞及其檢驗 第一章 現(xiàn)代造血理論,造血（hematopoiesis）是指血細胞的生成過程。 造血干細胞在造血微環(huán)境中增殖、分化為各類血細胞。 造血系統(tǒng)通過造血器官、造血干細胞、造血調控因子等組成的復雜網絡來維持血液細胞的動態(tài)平衡。,第一節(jié) 造血器官和造血微環(huán)境,一、造血器官 人體的造血器官是生成血液的器官 起源于中胚葉，主要包括骨髓、胸腺、淋巴結、 肝臟和脾等 其造血過程分為胚胎期造血和出生后造血,（一）胚胎期造血器官,人類的血液細胞首先在卵黃囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均參與造血 根據(jù)發(fā)育過程中造血中心的轉移，胚胎期造血又分為三個時期： 卵黃囊造血期 、肝造血期 、骨髓造血期,

2、1卵黃囊造血期（中胚葉造血期） 始于胚胎3周左右，卵黃囊壁上的中胚層細胞開始分化聚集成團，稱為血島（blood island）。血島是人類最初的造血中心。 血島外周的細胞逐漸變長，分化為血管內皮細胞,血島中央的細胞形成多能造血干細胞，繼爾分化成幼稚紅細胞，以后大量的多能造血干細胞遷移至肝、脾、骨髓和淋巴組織繼續(xù)增殖、分化為干細胞。 胚胎 2個月后，卵黃囊逐漸退化、萎縮,被肝、脾取代其造血功能。,2肝造血期 始于胚胎第6周，是卵黃囊血島的造血干細胞移植到肝臟的結果，以造紅細胞為主，后期可生成粒細胞和巨核細胞。 肝臟是胚胎25個月的造血中心，持續(xù)至第7個月時，逐漸被骨髓造血替代。 此外脾、胸腺、淋

3、巴結等也參與造血。,胎肝造血的規(guī)律： 造血細胞分布在肝竇、肝細胞索之間。 胎肝造血以幼稚紅細胞為主，巨核細胞常與紅系細胞在一起。 胎肝造血細胞的密度隨妊娠日期的不同而變化。證明肝造血在第15周以前為上升期，1530周為旺盛期，24周以后為減退時期，至出生前停止。 故肝造血為第二代造血。,脾造血 始于胚胎第3個月，主要生成紅細胞、粒細胞，第5個月時產生淋巴細胞、單核細胞，而紅細胞和粒細胞的產生逐漸減少。至出生時，脾已成為產生淋巴細胞的器官。 胸腺 在胚胎期主要產生淋巴細胞和少量紅細胞、粒細胞，胚胎后期成為誘導和分化T淋巴細胞的器官。 淋巴結 在胚胎早期可產生紅細胞，但時間很短，在胚胎4個月以后，

4、成為終生制造淋巴細胞和漿細胞的器官。,3骨髓造血期 自胚胎第14周骨髓開始造血，5個月以后成為胚胎期的造血中心。 骨髓中的造血干細胞來源于肝、脾的種植，可維持終生。 胚胎期的骨髓主要生成紅細胞、粒細胞和巨核細胞，也生成淋巴細胞和單核細胞。,胚胎期造血的三個時期是不能截然分開，而是此消彼長，互為交錯。,（二）出生后造血,出生后造血主要靠骨髓。 在正常情況下骨髓是唯一能產生紅細胞、粒細胞和血小板的場所，也生成淋巴細胞和單核細胞。 脾和淋巴結為終生制造淋巴細胞的器官。,1骨髓 骨髓是位于骨髓腔內的海綿樣膠狀組織，有紅骨髓和黃骨髓之分。 嬰幼兒的骨髓幾乎都參與造血，即全為紅骨髓。 大約從5歲開始，長骨

5、的髓腔內出現(xiàn)脂肪細胞，隨年齡增長，長骨遠端的紅骨髓逐漸被脂肪組織代替轉化為黃骨髓。,到18歲以后，紅骨髓只限于顱骨、脊椎骨、肋骨、胸骨、骼骨以及長骨的近心端。 因此，在作骨髓穿刺或活檢時，成人可選擇的部位是骼骨、棘突、胸骨等處， 脛骨粗隆則只適用于2歲以下的幼兒。 成人的紅骨髓和黃骨髓約各占50%，但黃骨髓仍有造血潛能，當機體需要時又轉變?yōu)榧t骨髓而參與造血。,2.淋巴器官 分為中樞淋巴器官和周圍淋巴器官。 中樞淋巴器官主要包括胸腺和骨髓，主導淋巴細胞的產生、增殖、分化和成熟。 周圍淋巴器官主要包括淋巴結、脾、腸粘膜相關淋巴組織等，是淋巴細胞聚集和免疫應答發(fā)生的場所。,(1)胸腺（thymus）

6、 來自骨髓的淋巴干細胞經增殖和在胸腺素的作用下，誘導分化為免疫活性細胞，進入胸腺髓質，然后釋放入血并遷移到外周淋巴器官的胸腺依賴區(qū)成為胸腺依賴淋巴細胞即T細胞。青春期后，胸腺逐漸退化，被脂肪組織取代。,(2)淋巴結（lymph node） 淋巴結的外周部分為皮質，B細胞在淋巴結皮質區(qū)濾泡中央增殖、發(fā)育； 皮質深層和濾泡間隙為副皮質區(qū)，富含由胸腺遷移而來的T細胞，又稱胸腺依賴區(qū)； 淋巴結中央部分為髓質，髓質區(qū)的B細胞、漿細胞及巨噬細胞集結構成髓索,(3)脾 脾切面大部分呈暗紅色，稱紅髓，其中散布著許多灰白色小結節(jié)，為白髓。 白髓是淋巴細胞的聚集處，在中央小動脈周圍主要是T細胞，是脾的胸腺依區(qū)；

7、白髓中的脾小結位于脾動脈周圍淋巴鞘內一側，內有生發(fā)中心，主要由B細胞構成。 脾具有造血、儲血及免疫等多種功能，是T、B細胞分化成熟的主要場所之一。,3.髓外造血 正常情況下，胎兒出生2個月以后，骨髓以外的組織如肝、脾淋巴結等不再制造紅細胞、粒細胞和血小板。 但在某些病理情況下，如骨髓纖維化、骨髓增生性疾病及某些貧血，這些組織又恢復造血功能（?？蓪е孪鄳鞴倌[大），稱為髓外造血。,髓外造血是機體對血細胞的需求特別增高或對骨髓造血障礙的一種補償， 尤其常見于兒童。 這種代償作用有限且不完善。 髓外造血部位除肝、脾、淋巴結外，也可以累及胸腺、腎、腎上腺、腹腔后脂肪及胃腸道。,二、造血微環(huán)境,造血微環(huán)

8、境（hematopoietic microenvironment）是指造血細胞生長、發(fā)育的內環(huán)境。 由微血管系統(tǒng)、末梢神經、基質、基質細胞及基質細胞分泌的細胞因子等組成，不僅是造血細胞的支架，還可通過細胞之間的相互作用和釋放的細胞因子影響造血活動。,（一）骨髓微血管系統(tǒng),骨髓微血管系統(tǒng)是造血微環(huán)境的重要組成部分,其功能在于向造血組織輸送營養(yǎng)物質，排出代謝廢物，從而有利于造血細胞的更新。 毛細血管注人管腔膨大的靜脈竇，再彼此溝通匯集成集合竇，最后進人中央靜脈。 靜脈竇與集合竇（統(tǒng)稱為骨髓血竇）是骨髓血管系統(tǒng)的核心結構。,血竇（Sinusoid） 是動脈毛細血管分成的不規(guī)則竇狀腔隙。 血竇內是成熟

9、的血細胞，血竇之間則充以骨髓實質(造血索)，主要是活躍的造血實質細胞。 血竇壁是由連續(xù)的內皮細胞、顆粒狀基底膜和外皮細胞所組成，其竇壁的薄厚是可變的,絕大多數(shù)的竇壁僅有一層內皮細胞組成，平時無孔，當血細胞穿過內皮細胞時形成臨時通道。,不同造血功能的骨髓其微血管的結構不同 造血功能旺盛時，骨髓血竇很豐富，竇壁孔隙增多； 造血功能低下的骨髓，骨髓血竇減少，無造血功能的黃骨髓中，微血管呈毛細管狀。 骨髓的微血管系統(tǒng)通過調節(jié)物質與能量的交換、血細胞的釋放、組織內的酸堿度、氧和二氧化碳分壓等影響造血細胞的增殖和分化。,（二）骨髓神經,骨髓的神經來源于脊神經，其神經供應十分廣泛，骨髓的全部動脈都伴有神經束

10、，其分支纏繞于動脈壁呈網狀，神經纖維終止于動脈壁的平滑肌纖維。 骨髓小動脈上的交感神經纖維受延髓血管運動中樞的控制，但絕大多數(shù)的骨髓微血管床主要受血管活性物質的調節(jié)。,骨髓神經的作用： （1）通過調節(jié)血管的舒縮，改變血竇的大小及血流速度的快慢等影響造血 （2）神經分泌的體液因子可直接作用于造血細胞 （3）基質細胞分泌的細胞因子調節(jié)造血功能,（三）基質細胞及其分泌的調控因子,骨髓基質細胞包括成纖維細胞、內皮細胞、脂肪細胞和巨噬細胞等， 它們通過與造血干細胞的密切接觸起到支持和營養(yǎng)造血細胞的作用。 各種基質細胞都有分泌細胞因子的功能，其分泌的生物大分子物質都與造血細胞的粘附有關，可粘附固定造血細胞

11、。,基質細胞還分泌多種細胞因子， 如白細胞介素、FLT-3配基、干細胞因子、粒一巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子等， 這些細胞因子不僅直接作用于造血細胞，而且作用于基質細胞，改變基質細胞的增殖和分泌狀況，誘導其它細胞因子的生成。 對造血細胞的增殖、分化和發(fā)育成熟起重要的調控作用。,Go on.,第二節(jié) 造血細胞的生長發(fā)育和造血調控,一、造血細胞的生長發(fā)育 胚胎造血組織的發(fā)育是血細胞發(fā)生、發(fā)育研究的基礎，也是血液學研究必不可少前提。 造血細胞的生長發(fā)育是一個連續(xù)不斷的復雜過程，造血器官內的各種造血細胞在造血微環(huán)境中通過細胞與細胞之間的相互作用，在各種細胞因子的誘導下

12、，按一定的規(guī)律發(fā)育成為各種成熟的血細胞，然后釋放入血循環(huán)中。,（一）造血細胞生長發(fā)育的概念,造血細胞的生長發(fā)育包括增殖、分化、成熟和釋放四個方面。 造血細胞的增殖是指血細胞通過分裂而使其數(shù)量增加的過程。 有絲分裂是造血細胞的主要增殖方式。,母細胞有絲分裂后形成的子細胞同時都傾向分化成熟。 子細胞還可進一步增殖，每增殖一次就越傾向于進一步分化。 一般來講，一個原始細胞到成熟細胞可經過45次分裂，如1個原始紅細胞可產生32個或64個成熟紅細胞。 而巨核細胞的增殖（連續(xù)雙倍增殖DNA）與其他系統(tǒng)血細胞的增殖方式不同，每增殖一次，核增大一倍，但胞質并不分裂，屬多倍體細胞，形態(tài)上也表現(xiàn)為從原始到成熟胞體

13、逐漸變大。,造血細胞的分化（differentiation） 是指細胞發(fā)育過程中失去某些潛能又獲得新的功能的過程，即由多潛能轉變?yōu)閱螡撃艿倪^程。 分裂后的細胞在形態(tài)和功能上產生了新的特征，分化過程是不可逆的。,造血細胞的成熟（maturation） 是細胞從造血干細胞定向分化后，從原始經幼稚到成熟的細胞發(fā)育過程， 血細胞越成熟其形態(tài)越易辨認，功能也日趨完善。,成熟的血細胞在骨髓內通過“髓血屏障”釋放入血循環(huán)中，各種調節(jié)因素控制著血細胞的增殖、分化、成熟和釋放，從而維持血細胞數(shù)量和質量的穩(wěn)定。,（二）造血細胞生長發(fā)育的過程,根據(jù)造血細胞的功能和形態(tài)特征， 造血細胞的生長發(fā)育過程可為： 造血干細胞

14、、造血祖細胞、原始及幼稚細胞三個階段。 原始及幼稚細胞階段的細胞是在骨髓涂片中從形態(tài)學上可以辨認各系各階段的血細胞。,造血干細胞階段,造血組細胞階段,原始及幼稚細胞階段,成熟細胞,二、造血干祖細胞,干細胞（stem cell）是具有自我復制和多向分化能力的細胞。 早期胚胎中的原始生殖細胞即胚胎干細胞，具有廣泛的發(fā)育和分化潛能，稱為全能干細胞（totipotent hematopoietic stem cell,T HSC）。 胚胎干細胞可分化為各類組織干細胞，造血組織中存在造血干細胞、血管干細胞和間質干細胞。,（一）造血干細胞,造血干細胞（hematopoietic stem cell, HS

15、C）的概念于20世紀初就有人提出，但當時的含義不甚明確，研究內容模糊不清，直至發(fā)現(xiàn)了脾集落形成單位之后，造血干細胞在六七十年代引起了人們的關注。 隨著新技術的發(fā)展，造血干細胞在臨床應用等方面潛在的巨大價值被逐步發(fā)現(xiàn)，目前已成為生命科學研究領域的熱門課題。,造血干細胞又稱多能干細胞，由中胚層細胞分化而來，是各種血細胞的始祖，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血組織中含量極少，其形態(tài)酷似小淋巴樣細胞而難以辨認。 在體內造血干細胞多數(shù)處于G0期。 造血干細胞可增殖分化為髓系干細胞和淋巴干細胞。,1.造血干細胞的基本特征 (1)自我更新：即細胞通過有絲分裂產生的兩個子代細胞與親代細胞具有相

16、同的特征。造血干細胞的自我更新是維持其數(shù)量平衡的基礎，亦稱自我維持。高度的自我更新能力是造血干細胞基本的生物學特征之一。,(2）多向分化：即造血干細胞具備分化為各系造血祖細胞的潛能，是造血干細胞的另一個基本的生物學特征，造血干細胞的分化受到多種正負調控因子的調節(jié)，在特定的條件下可以分化成紅細胞、粒細胞（中性、嗜酸性、嗜堿性）、單核細胞、血小板、組織嗜堿細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞及自然殺傷細胞等的祖細胞。 分化是不可逆的，造血干細胞一旦定向分化為某種祖細胞，就不可能再變成其他的祖細胞。,2造血干細胞檢測 單個細胞在生物體內有能力長期重建造血是判斷該細胞為造血干細胞的“金標準”。 由于造血干細胞

17、的數(shù)量極少，且形態(tài)上不能區(qū)別，也沒有造血干細胞的表面標志，目前還沒有建立體外直接測定造血干細胞的方法。,（1）脾集落測試法 1961年Till等首先采用體內試驗小鼠脾集落形成間接證明了造血干細胞的存在： 將受體小鼠以致死劑量射線照射后，破壞全部造血細胞，動物因造血功能衰竭而死亡；如輸以供體骨髓或血液，小鼠能存活，并在受體小鼠脾中形成紅系、粒系、巨核系細胞組成的結節(jié)即脾集落，經證實所有這些細胞都是由單個細胞增殖分化而來，即脾集落形成單位（CFU-S）； 如將脾結節(jié)細胞靜脈注射給受體小鼠，該小鼠也能存活。證實了骨髓或血液中存在血液細胞的祖先細胞。,20世紀80年代出現(xiàn)了一系列體外檢測造血干細胞的試

18、驗方法，但只能部分證實造血干細胞自我更新和多向分化兩個特征， 如混合集落(CFU-Mix )培養(yǎng)， 高增殖潛能細胞(HPP-CFC）培養(yǎng)， 原始細胞集落形成細胞（CFU-Blast )培養(yǎng)，長期培養(yǎng)起始細胞（LTC-IC )檢測等。,（2）單克隆抗體法 利用FACS自動細胞分選系統(tǒng)分選出單個CD34+細胞亞群細胞-CD34+CD38+及CD34+CD38，在無血清體系中加入各種細胞因子（如SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF及Epo）刺激，結果表明，CD34+ CD38單個細胞可形成原代集落，并可向紅系、粒系、巨噬系、巨核系等 細胞分化。 證明了CD34+CD38細胞的性能接近于造血干細胞

19、，同時也證明了造血干細胞具有多向分化的能力，還有實驗表明，造血干細胞具有向淋巴細胞分化的能力。,目前造血干細胞的表面標記尚未確定。 一般認為CD34陽性細胞具有長期重建造血的能力，推測部分造血干細胞CD34陽性； CD34陽性CD38陰性細胞比CD34陽性細胞具有更強的長期造血能力； AC 133陽性細胞也被認為是早期造血細胞的標志。 明確造血干細胞的表面標記不但具有重要理論價值，也有助于分離純化高質量的造血干細胞供臨床應用。,（二）造血祖細胞,造血干細胞進一步分化為各種造血祖細胞 （hematopoietic progenitor cell）。 造血祖細胞是一類由造血干細胞分化而來，但失去自

20、我更新能力的過渡性、增殖性的細胞群，過去稱為定向干細胞。,造血祖細胞有年齡結構，根據(jù)其分化能力，可分為多向祖細胞和單向祖細胞， 多向祖細胞可進一步分化 為單向祖細胞。 通過體外造血細胞半固體培養(yǎng)證實了造血祖細胞的存在。,產生紅細胞的祖細胞稱為： 紅細胞爆式集落形成單位（BFU-E)（早期） 和紅細胞集落形成單位(CFU-E),BFU-E,產生粒細胞和單核細胞的祖細胞稱為： 粒-單核細胞集落形成單位（CFU-GM）,CFU-GM,產生巨核細胞的祖細胞稱： 巨核細胞集落形成單位（CFU-Meg）,CFU-Meg,另外，產生嗜酸性粒細胞的祖細胞稱為嗜酸性粒細胞集落形成單位（CFU-Eo）； 產生嗜堿

21、性粒細胞的祖細胞稱為嗜堿性粒細胞集落形成單位（CFU-Bas）； 產生T淋巴細胞的祖細胞稱為T淋巴細胞集落形成單位（CFU-TL）； 產生B淋巴細胞的祖細胞稱為B淋巴細胞集落形成單位(CFU-BL) 。 這些祖細胞失去了自我更新的能力，但有較強的增殖和定向分化能力。 造血祖細胞表面的主要免疫標記已明確，因此，根據(jù)這一特性，可采用流式細胞術或其他免疫學技術來分析造血祖細胞，甚至可以使之分離純化。,（三）造血干祖細胞的臨床應用,造血干祖細胞的臨床應用主要涉及到造血干祖細胞移植。 目前造血干祖細胞主要來源于骨髓、外周血和臍血，不同來源的造血干祖細胞的移植在臨床上各有其優(yōu)缺點。,造血干祖細胞移植主要應

22、用于： 1.血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如急、慢性白血病等； 2.血液系統(tǒng)非惡性腫瘤性疾病，如再生障礙性貧血、異常血紅蛋白病、Fanconi貧血、難治性貧血等； 3.實體腫瘤化療后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神經母細胞瘤等； 4.其他，如重癥聯(lián)合免疫缺陷癥、自身免疫性疾病、基因治療等。,三、造血調控,造血細胞的增殖、分化受控于不同的調控系統(tǒng)，以保持各種血細胞數(shù)量和質量的相對穩(wěn)定。 造血調控作用于血細胞發(fā)育的每一階段，體內許多因素參與了這一過程，其中細胞因子的調控占重要地位。 細胞因子（cytokines）是一組基因編碼的低分子量蛋白質細胞外信號分子，有的是糖蛋白，有的則不含糖基，在機體內含量極低，半衰期

23、短，主要功能是在細胞間傳遞信息，從而影響造血活動。,（一）集落刺激因子類 ( colony-stimulating factors, CSFs ) CSFs在半固體細胞培養(yǎng)中能促進造血細胞集落形成。主要有以下幾種： 1.紅細胞生成素（erythropoietin，EPO） 主要的生物學功能是刺激紅系祖細胞的增殖和分化，以提高紅細胞數(shù)量。 2.粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 除促進粒系祖細胞形成集落外，G-CSF可誘導某些白血病細胞株分化成熟，激活中性粒細胞的吞噬功能，誘導早期造血干祖細胞從場期進人細胞周期。,3.粒一巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) GM-CSF除了促進中性粒細胞、單核細

24、胞祖細胞增殖、分化成熟外，對成熟細胞也產生作用 4.巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF） 促進單核系祖細胞的增殖和分化，激活巨噬細胞的吞噬和分泌功能。 5.多系集落刺激因子（multi-CSF） 促進造血干祖細胞的增殖、分化，促進多系集落生長。 6.血小板生成素（thrombopoietin, TPO）促進造血干祖細胞的增殖、分化；促進巨核細胞集落形成。,（二）白細胞介素（interleukin, IL) 白細胞介素主要是白細胞產生的信號分子，不僅在免疫系統(tǒng)中傳遞信息，同時也參與造血系統(tǒng)的造血調控，其主要生物學功能見（臨床免疫學檢驗。,（三）其他細胞因子 1.干細胞因子（stem cell fa

25、ctor, SCF） 又稱肥大細胞生長因子 促進肥大細胞生長；協(xié)同促進造血干祖細胞增殖、分化。 2FLT-3配基(FLT-3 ligand, FL) 誘導處于靜止期的造血干祖細胞進人細胞周期，促進其擴增。,目前發(fā)現(xiàn)對造血有調節(jié)作用的細胞因子有近50種，它們對造血的調控有正向和負向調節(jié)，一種細胞因子對一類細胞可能以正向調節(jié)為主，而對另一類細胞則可能是反向抑制，并且不同的濃度作用效果也不一樣。 大多數(shù)人類的細胞因子可以通過基因工程制備，有的已成功用于臨床，如EPO較早地用來治療各種貧血，尤其是與腎功能衰竭、化療、腫瘤骨髓浸潤有關的貧血，取得了顯著療效；G-CSF應用于治療化療引起的中性粒細胞減少癥，骨髓移植和外周血造血干祖細胞的動員等。,第三節(jié) 造血干祖細胞體外培養(yǎng)技術,體內造血干祖細胞在一個極復雜的造血微環(huán)境中增殖、分化生成血液細胞。 體外造血祖細胞培養(yǎng)就是在體外模擬體內的生理環(huán)境，將從機體中分離出的造血祖細胞進行培養(yǎng)，使之生存、增殖分