1、2010/11/29,培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)Biology Character,余莉 安徽醫(yī)科大學(xué)微生物教研室 yl_,2009/12/04,內(nèi)容提要,培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型 培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn) 培養(yǎng)細(xì)胞生長過程 培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察,2009/12/04,內(nèi)容提要,培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型 培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn) 培養(yǎng)細(xì)胞生長過程 培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察,2009/12/04,培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式,按生長方式:2型 粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才 能生長的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而 在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。 絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞， 只有少數(shù)細(xì)胞類型

2、如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞 可在懸浮狀態(tài)下生長,2009/12/04,一：粘附生長型細(xì)胞 （較為多見）,粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi) 生存和生長發(fā)育的基本存在方式 含義: 兩方面 其一是細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸 其二是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合 結(jié)果: 基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織， 有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須 粘附于一固相表面 才能生存和生長。,2009/12/04,培養(yǎng)時：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細(xì)胞。 粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞。,一：粘附生長型細(xì)胞 （較為多見）,2009/12

3、/04,類型 細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位 外形具有復(fù)雜的立體特征 體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個附著平面 外形一般與體內(nèi)時明顯不同,一：粘附生長型細(xì)胞 （較為多見）,2009/12/04,按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài),可將其分為,成纖維細(xì)胞型 上皮細(xì)胞型 游走型細(xì)胞 多型性細(xì)胞,2009/12/04,1.成纖維型細(xì)胞：(fibroblast)來自中胚層,名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的 來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織 如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞 形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出23個長短不等的突起 中有卵圓形核,

4、2009/12/04,生長特點(diǎn): 排列成放射狀，漩渦狀, 并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而, 單獨(dú)行動 游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞 常有幾個伸長的細(xì)胞突起,1.成纖維型細(xì)胞：(fibroblast)來自中胚層,2009/12/04,1.成纖維型細(xì)胞：(fibroblast)來自中胚層,2009/12/04,2、上皮細(xì)胞型(epithlium cell type),名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全等于- 來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞 如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤 形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞 扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核,2009/12/04,生長特點(diǎn) 易相連成片 相

5、靠緊密相連成薄層鋪石狀 生長時呈膜狀移動 很少脫離細(xì)胞群而單個活動,2、上皮細(xì)胞型(epithlium cell type),2009/12/04,2、上皮細(xì)胞型(epithlium cell type),2009/12/04,肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞,2、上皮細(xì)胞型(epithlium cell type),2009/12/04,2、上皮細(xì)胞型(epithlium cell type),2009/12/04,3、游走型細(xì)胞(wandering cell type),特點(diǎn)：在支持物上散在生長,不連接成片,胞質(zhì)伸出偽足或突起呈活躍的游走或變形運(yùn)動,速度快不規(guī)則, 密度大連接成片呈多角形不易與其他類型的細(xì)

6、胞區(qū)別。,2009/12/04,表現(xiàn)這種形態(tài)的細(xì)胞主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞,如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝枯否細(xì)胞(pffer cell)以及某些腫瘤細(xì)胞等。在植塊培養(yǎng)時,這類細(xì)胞最先從植塊遷移出來。,3、游走型細(xì)胞(wandering cell type),2009/12/04,2009/12/04,2009/12/04,2009/12/04,4、多形型細(xì)胞(polymorphic cell type),特點(diǎn)： 無規(guī)律的形態(tài)，如神經(jīng)細(xì)胞。,2009/12/04,2009/12/04,新生24小時wistar大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞 1.細(xì)胞種類：大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞；

7、 2.培養(yǎng)的天數(shù)：5 天； 3.放大倍速：倒置顯微鏡 X200倍； 4.培養(yǎng)基種類：DEME-F12N2 5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：神經(jīng)細(xì)胞聚集成球，向外爬行生長，各神經(jīng)球之間 有豐富的神經(jīng)絲聯(lián)系。單個神經(jīng)細(xì)胞胞體呈錐形或圓形，樹突交錯呈網(wǎng)，貼 壁生長。,2009/12/04,（二）懸浮生長型細(xì)胞(suspended cell type),概念 培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長 來源 自血，脾或骨髓， 尤以血中白細(xì)胞 癌腫細(xì)胞也可能 特點(diǎn) 在懸浮中生長良好 細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團(tuán),2009/12/04,優(yōu)點(diǎn) 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化) 易于

8、收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點(diǎn) 觀察不方便 很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞),（二）懸浮生長型細(xì)胞(suspended cell type),2009/12/04,胚胎干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成的擬胚體 倒置顯微鏡20,（二）懸浮生長型細(xì)胞(suspended cell type),2009/12/04,2009/12/04,2009/12/04,強(qiáng)調(diào)：一般形態(tài)并不是一項(xiàng)可靠指標(biāo)要受各方面 影響。 如：反復(fù)開關(guān)溫箱、溫度、C02的濃度、培養(yǎng)基變堿、支原體、pH值。細(xì)胞在接種時呈三角型狀態(tài)，經(jīng)培養(yǎng)一定時間后，細(xì)胞在傳代前已形成上皮型細(xì)胞。,細(xì)胞形態(tài)受環(huán)境的影響,2009/12/04,細(xì)胞貼壁延展過程,2

9、009/12/04,培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定血清 Hela 高血清 低血清 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 pH Hela 太酸或太堿 標(biāo)準(zhǔn)pH 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 細(xì)胞密度 3T3 低密度 高密度 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 生長狀態(tài)改變 懸浮或貼附 懸浮 貼附 圓形 成纖維或上皮樣 轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化后 成纖維樣 可成上皮樣,細(xì)胞形態(tài)受環(huán)境的影響,2009/12/04,衰退期細(xì)胞,2009/12/04,衰退期細(xì)胞,2009/12/04,內(nèi)容提要,培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型 培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn) 培養(yǎng)細(xì)胞生長過程 培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察,2009/12/04,總的：與體內(nèi)仍有相似- 體外培養(yǎng)的細(xì)胞

10、仍存在細(xì)胞和細(xì)胞、 細(xì)胞和基質(zhì)的相互關(guān)系 但有不同 相對孤立、相對單一 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài) 分化減弱或不顯 萬變不離其宗，入鄉(xiāng)隨俗 1.去分化 2. 貼壁和鋪展 3. 接觸抑制和密度依賴性生長抑制,二、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn),2009/12/04,1.去分化,細(xì)胞分化(cell differentiation) 細(xì)胞分化是指在個體發(fā)育中，由一種相同的細(xì)胞類型經(jīng)細(xì)胞分裂后逐漸在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上形成穩(wěn)定性差異，產(chǎn)生不同的細(xì)胞類群的過程。 分化的結(jié)果是在空間上，細(xì)胞之間出現(xiàn)差異；在時間上同一細(xì)胞和它以前的狀態(tài)有所不同。從本質(zhì)上說，細(xì)胞分化是從化學(xué)分化到形態(tài)、功能分化的過程。 只有通過細(xì)胞分化

11、,才能形成各種不同的細(xì)胞,進(jìn)而形成不同的各具功能的器官,使生物體成為一個個體,否則假如細(xì)胞只是長大變多也就是說只有干重的增加而不分化,所有的細(xì)胞都只能保持原始的干細(xì)胞的狀態(tài)也就無法形成生物體了。,2009/12/04,2009/12/04,培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的變化,體內(nèi)細(xì)胞-三方面的影響與調(diào)節(jié): 體外環(huán)境的影響 體內(nèi)神經(jīng)體液因素 的調(diào)節(jié) 細(xì)胞與局部微環(huán)境的相互作用 控制- 維持著細(xì)胞的分化特征。 體外培養(yǎng)時， 失去了- 分化特征逐漸減弱,2009/12/04,去分化(脫分化):是指已分化成熟的細(xì)胞和組織倒退分化,返回原始幼稚的狀態(tài) (逐漸失去各自的形態(tài)與功能“個性”，表現(xiàn)出某種趨同性) 有2點(diǎn),

12、去分化,2009/12/04,1. 去分化并不意味著完全返回胚胎時期的原始細(xì)胞狀態(tài)如:高度分化的神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞 已經(jīng)喪失的增生活性不可能恢復(fù) 但已經(jīng)具備的生物電活動特性 不會完全失去,去分化,2009/12/04,2. 可重新表現(xiàn)出分化特點(diǎn) 如：把表皮細(xì)胞放在氣液界面上培養(yǎng)，可分化成 含大量角蛋白絲的角質(zhì)細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞-但，這種能力會隨著培養(yǎng)時間延長 逐漸喪失總之，體外培養(yǎng),使細(xì)胞 結(jié)構(gòu)與功能上的“可塑性”增大,去分化,2010/11/29,2.貼附和鋪展,2009/12/04,貼附(粘附)和附著,粘附于固相表面是錨定依賴性細(xì)胞生命活動的基本要求細(xì)胞被接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)以后首先要發(fā)生粘附(a

13、dherence)， 是細(xì)胞培養(yǎng)以后能否成功的第一步.細(xì)胞懸液后 耽擱得越久，越容易發(fā)生退化提供什么樣的生長表面 是細(xì)胞能否成功粘附的主要因素。,2009/12/04,不同細(xì)胞的粘附能力不同 如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等粘附能力強(qiáng) 能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面 如神經(jīng)元細(xì)胞、羊水細(xì)胞，粘附能力弱 需要數(shù)小時乃至更長的時間才能粘附到固相表面 粘附能力強(qiáng)的細(xì)胞- 粘附能力弱的細(xì)胞- 可利用此特點(diǎn)（粘附：快、牢；慢、弱） 分離、純化細(xì)胞,貼附(粘附)和附著,2009/12/04,細(xì)胞形態(tài)因是否貼附于底物而不同懸浮的細(xì)胞: 基本圓形粘附和貼壁的細(xì)胞: 扁平圓形 相差顯微鏡 “亮圈” 很快過渡-,貼

14、附(粘附)和附著,2009/12/04,貼附過程 ：3步 貼附因子粘附 細(xì)胞開始附著 細(xì)胞進(jìn)一步牢固附著伸展,貼附(粘附)和附著,2009/12/04,各種細(xì)胞不同 如接種30后第二瓶30 (附著最強(qiáng))巨噬細(xì)胞一成纖維細(xì)胞 上皮細(xì)胞血細(xì)胞(最弱) 生物因素 血清、培養(yǎng)液中的促附著因子 機(jī)械，物理等其他因素因素 離心：促進(jìn)附著 流動：培養(yǎng)液流動可阻止細(xì)胞附著 低溫：可抑制附著,影響因素,2009/12/04,1.包被對分化程度高、生長能力差的細(xì)胞 可在培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細(xì)胞粘附和 生長的生物活性物質(zhì) 如:- 通過其所帶電荷先吸附-, 培養(yǎng)的細(xì)胞再與其結(jié)合。 血清內(nèi)含有多種能夠 促進(jìn)細(xì)胞粘附的

15、成分 細(xì)胞本身也可能產(chǎn)生一些粘附分子,措施（因素）,2009/12/04,2.減少接種時細(xì)胞懸液的量待細(xì)胞粘附和貼壁之后，再補(bǔ)充足夠的培養(yǎng)液 3.減少培養(yǎng)液中血清的含量 使培養(yǎng)液黏度降低 4.培養(yǎng)液中離子成分及其濃度 如，培養(yǎng)液中的Ca含量過低時不利于 細(xì)胞的粘附、貼壁和鋪展 5.培養(yǎng)液的溫度 低溫會減低細(xì)胞的活動，妨礙黏附和貼壁,措施（因素）,2009/12/04,鋪展,鋪展（伸展） (spread) 進(jìn)行生命活動的一種基本的生長特點(diǎn)或生長行為 鋪展?fàn)顩r制約細(xì)胞的分裂增殖活動過程，細(xì)胞先由圓形變?yōu)?圓餅形(放射狀鋪展細(xì)胞) 逐漸鋪開伸展成為扁平的極性細(xì)胞 極性細(xì)胞就是各種有機(jī)體細(xì)胞 在體外的

16、特征性 細(xì)胞形態(tài),2009/12/04,鋪展?fàn)顩r 是調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀的主要方面 鋪展得越好，細(xì)胞越扁 意味著細(xì)胞與生長基質(zhì)表面接觸面越大 鋪展?fàn)顩r 與細(xì)胞的生長有密切關(guān)系 只有當(dāng)細(xì)胞鋪展到合適的程度 DNA合成才開始進(jìn)行 通過比較貼壁依賴性細(xì)胞 不同鋪展程度與DNA合成率之間的關(guān)系 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞越扁(厚度越小) DNA合成率越高,鋪展,2009/12/04,合適的細(xì)胞形狀-伸展細(xì)胞形狀(伸展) 與細(xì)胞的生長 對正常細(xì)胞的DNA合成重要 對其生長重要,伸展的意義,2009/12/04,實(shí)驗(yàn)一 成纖維細(xì)胞1. 附著于玻璃或塑料底物: 細(xì)胞增殖2. 懸浮培養(yǎng): 細(xì)胞不增殖3. a. 培養(yǎng)在懸浮的玻璃纖維上:

17、 若夠長: 細(xì)胞可增殖 若短于20um, 細(xì)胞可附著, 但增殖很慢 或不增殖,伸展的意義,2009/12/04,原因分析在1. 附著培養(yǎng)物上: 細(xì)胞很扁平, 很伸展在2. 懸浮培養(yǎng)中: 細(xì)胞圓球形, 未伸展在3. 培養(yǎng)中: 細(xì)胞維持介于扁平與圓球之間因此, 細(xì)胞形狀, 至關(guān)重要伸展至原來的形態(tài), 才能增殖,伸展的意義-實(shí)驗(yàn),2009/12/04,細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中時，近似球體形狀 當(dāng)接觸堅硬平面 即鋪展于底物上，扁平狀 與底物形成很多接觸點(diǎn),伸展過程,2009/12/04,(1)開始階段 開始附著鋪開 細(xì)胞附著于底物 球形的細(xì)胞，下方表面與底物接觸成扁 但尚未形成新的偽足,伸展分幾個階段,20

18、09/12/04,(2) 放射狀鋪展階段在球形細(xì)胞體的周圍形成很多偽足隆起偽足形狀 主要 柱形絲狀: 直徑0.2-0.5um 長10-20 扁平片狀: 厚0.1-0.5 寬2-5 尚有: 小泡狀葉狀: 直徑1-2 開始時: 絲狀多 以后: 片狀增加,伸展分幾個階段,2009/12/04,許多偽足 形成薄的胞質(zhì)小片牢固貼于底物 胞體中央部分 扁 整亇細(xì)胞扁平 (3) 極化階段,伸展分幾個階段,2009/12/04,底物 細(xì)胞能在很多固體表面附著 最終鋪展的程度，取決于底物的性質(zhì) 影響因素： 活性物質(zhì)(貼附、伸展因子):血清、培養(yǎng)液中， 或細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)被底物吸附后可利于細(xì)胞的鋪展 細(xì)胞借

19、助這些分子,可附著于各種”非特異性”的底物上 如膠原，聚賴氨酸 機(jī)械，物理因素,附著、伸展的條件,2009/12/04,3.接觸抑制和密度依賴性生長抑制,正常細(xì)胞：細(xì)胞相互接觸能抑制細(xì)胞運(yùn)動，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制(contact inhibition)。 腫瘤細(xì)胞：沒有這種現(xiàn)象，可作為區(qū)別正常與腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一。當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá)到一定密度后向三維空間發(fā)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積(piled up)。 由于細(xì)胞不斷增殖分裂，細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增多，培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多，細(xì)胞受營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制(Density inhibition),導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。,2009/12/04,

20、3.接觸抑制和密度依賴性生長抑制,2009/12/04,運(yùn)動的接觸抑制,2009/12/04,密度依賴性生長抑制,增殖的密度抑制 實(shí)驗(yàn) 方法：3T3細(xì)胞，接種105于6cm培養(yǎng)皿， 5d細(xì)胞計數(shù) 于加入10、20、30牛血清的 培養(yǎng)液中，結(jié)果：,2009/12/04,結(jié)果： 10血清： 20hr后鋪滿 (匯合confluent) 以后至5d 細(xì)胞數(shù)不再增加 (細(xì)胞 數(shù)約1066cm皿) 密度抑制 30%血清： 以后經(jīng)常換液至5d， 細(xì)胞密度繼續(xù)增加 (可達(dá)6xl066cm皿) 說明: 密度抑制-鋪滿后 不再增殖(分裂停止) 血清可降低密度抑制,密度依賴性生長抑制,2009/12/04,只加入于

21、3T3停止生 長的培養(yǎng)液中 細(xì)胞不生長 當(dāng)再加入血清 細(xì)胞又生長 說明血清可消除密度抑制,密度依賴性生長抑制,2009/12/04,(2)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的密度抑制降低 用此培養(yǎng)液 3T3細(xì)胞不再分裂增殖 當(dāng)再加入10血清， 3T3細(xì)胞可再增殖 表示血清可消除密度抑制 但當(dāng)用此培養(yǎng)液， 于轉(zhuǎn)化的3T3細(xì)胞 (SV3T3) 卻生長良好 表示轉(zhuǎn)化細(xì)胞密度抑制降低 (血清需要降低) 說明：轉(zhuǎn)化細(xì)胞的密度抑制降低. 可生長至較高的密度,密度依賴性生長抑制,2009/12/04,總的說明： 細(xì)胞生長有密度抑制 血清可降低密度抑制 轉(zhuǎn)化細(xì)胞可降低密度抑制,密度依賴性生長抑制,2009/12/04,內(nèi)容提要,培養(yǎng)細(xì)

22、胞的生長方式及類型 培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn) 培養(yǎng)細(xì)胞生長過程 培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察,2009/12/04,三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程,細(xì)胞系的生長過程 每代貼附生長細(xì)胞的生長過程 細(xì)胞周期（細(xì)胞分裂周期）,2009/12/04,體外培養(yǎng)細(xì)胞的整個生命活動可分為 原(初)代培養(yǎng)期 傳(繼)代培養(yǎng)期 衰退期三個時期,（一）細(xì)胞系的生長過程,2009/12/04,2009/12/04,1、原代培養(yǎng)期,取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱 為原代培養(yǎng)。組織到第一次傳代 時間大約為14周 特點(diǎn)： 細(xì)胞活躍移動,分裂,但不旺盛,多呈二倍體核型。 原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動基本相似。

23、異質(zhì)性 各細(xì)胞的遺傳性狀互不相關(guān)，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)，如果把這種稀釋分散成單細(xì)胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明細(xì)胞獨(dú)立生存性差。,2009/12/04,2、傳代培養(yǎng)期,初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代便稱之為細(xì)胞系(cell line) 特點(diǎn)： 細(xì)胞增殖旺盛，并維持二倍體核型，也叫二倍體細(xì)胞系(diploid cell line)為了保存二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代或傳代早期凍存為好。 一般細(xì)胞在10代以內(nèi)凍存。 細(xì)胞逐漸進(jìn)入去分化狀態(tài)。 原本成分混雜的培養(yǎng)物中,某一種增殖能力較強(qiáng)的細(xì)胞會逐漸處于優(yōu)勢,比例越來越大,而將其它數(shù)量較少比例較小的細(xì)胞

24、逐漸淘汰掉。,2009/12/04,3、衰退期,特點(diǎn)：細(xì)胞仍生存 增殖減慢 不增殖 輪廓增強(qiáng) 衰退凋亡 注意：細(xì)胞在三期中的任何一期（一般發(fā)生在傳代后期或衰退期）在某些因素影響下,如血清質(zhì)量不佳、病毒污染、溫度和pH不穩(wěn)等,細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(spontaneous transformation);,2009/12/04,細(xì)胞可能獲得永生性(immortality) 或稱為惡性(malignancy)。細(xì)胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細(xì)胞群體稱為連續(xù)細(xì)胞系(continuous cell line)。而細(xì)胞獲得不死性后,細(xì)胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。,2009

25、/12/04,有限細(xì)胞系及連續(xù)細(xì)胞系的特征,2009/12/04,細(xì)胞株(Cell Strain) ：系用克隆培養(yǎng)、物理分離或其他選擇方法分離選擇，在培養(yǎng)的細(xì)胞群體中獲得了已經(jīng)被確認(rèn)的某種特殊特征，這樣的細(xì)胞系被稱之為細(xì)胞株。,2009/12/04,游離期 貼壁期 潛伏期 對數(shù)生長期 停止期（平臺期）,(二)每代貼附生長細(xì)胞的生長過程,2009/12/04,細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)也稱懸浮期。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。 10分鐘一4小時,游離期：,2009/12/04,細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等 血清中有促使

26、細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。 進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）,貼壁期：,2009/12/04,2009/12/04,2009/12/04,潛伏期特點(diǎn)： 長短與細(xì)胞接種密度、種類、使用的培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。 (1)細(xì)胞貼附后進(jìn)入潛伏期,細(xì)胞無增殖。少見分裂相，細(xì)胞有運(yùn)動活 動。 (2)初代培養(yǎng) 細(xì)胞潛伏期約為2496小時或更長， 連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期約624小時。 (3)細(xì)胞接種密度大潛伏期短。 (4)細(xì)胞出現(xiàn)分裂相增多時，標(biāo)志細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增生期。,潛伏期(late

27、nt phase) ：,2009/12/04,對數(shù)生長期(logarithmic growth phase),特點(diǎn)：細(xì)胞增殖最旺盛階段,分裂相增多。 細(xì)胞分裂指數(shù)(mitotie index MI) ： 表示每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。 條件：分裂相數(shù)與細(xì)胞種類、培養(yǎng)成分、 pH培養(yǎng)箱溫度有關(guān)。,2009/12/04,細(xì)胞分裂指數(shù)： 初代細(xì)胞：在0.10.5之間, 連續(xù)分裂細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞：3 5。 指數(shù)增生期是作為細(xì)胞一代活力最好的時期,是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最好和最主要的階段。 指數(shù)增生期持續(xù)35天，細(xì)胞數(shù)量增多后生長空間變小，細(xì)胞相互接觸可連接成片。,對數(shù)生長期(logarithmic growth

28、 phase),2009/12/04,特點(diǎn)：細(xì)胞不增殖,有代謝活動。培養(yǎng)液中的營養(yǎng)已逐漸耗盡,代謝產(chǎn)物積累增多,pH降低，此時需要傳代,否則細(xì)胞將會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,細(xì)胞會從底物脫落死亡。 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性抑制 注意：傳代過晚將影響下一代細(xì)胞的生長,至少要再傳 12代 ,通過換液淘汰死細(xì)胞和受損較輕的細(xì)胞。待細(xì)胞全部恢復(fù)后再用。 在這一點(diǎn)上要特別注意。,停止期 (stagnate phase) 平臺期（ plateau phase ）：,2009/12/04,細(xì)胞生長曲線,2009/12/04,（三）細(xì)胞周期（細(xì)胞分裂周期）,概念：指單個細(xì)胞的生長過程，亦指母細(xì)胞分裂后形成的細(xì)胞到

29、下一代再分裂成兩個子細(xì)胞之間的時期。細(xì)胞周期或者定義為：細(xì)胞從一次分裂結(jié)束時起，到下一次分裂結(jié)束為止的一段時期。,2009/12/04,具有進(jìn)入細(xì)胞周期能力的G0期細(xì)胞靜止細(xì)胞（Quiescent cell，Q細(xì)胞）休止細(xì)胞（Resting cell ),最終要死亡的終止分化細(xì)胞終端分化細(xì)胞,不分裂細(xì)胞,間期細(xì)胞（G1SG2）,有絲分裂期細(xì)胞（M）,分裂期細(xì)胞,群體細(xì)胞,整個細(xì)胞周期的組成即為 （G 1 0SG2M）,2009/12/04,2009/12/04,細(xì)胞周期可劃分為四個階段,2009/12/04,細(xì)胞周期調(diào)控,2001年10月8日美國人LelandHartwell、英國人Paul

30、Nurse、TimothyHunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而榮獲2001年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎,LelandHartwell 分離出了幾十個與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(cell division cycle gene，CDC)，如芽殖酵母的CDC28基因，在G2/M轉(zhuǎn)換點(diǎn)發(fā)揮重要的功能。 Paul Nurse 同樣發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞周期調(diào)控基因，如裂殖酵母的CDC2、 CDC25。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)cdc2和cdc28都編碼一個34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行。 TimothyHunt 1983年首次發(fā)現(xiàn)海膽卵受精后，在其卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期劇烈振蕩，在每一輪細(xì)胞間期開始合成，G2/M

31、時達(dá)到高峰，M結(jié)束后突然消失，下輪間期又重新合成，故命名為周期蛋白(cyclin)。,2009/12/04,內(nèi)容提要,培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型 培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn) 培養(yǎng)細(xì)胞生長過程 培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察,2009/12/04,常規(guī)觀察,培養(yǎng)液的顏色與透明度 細(xì)胞形態(tài)變化 細(xì)胞污染的觀察及防治 細(xì)胞生長狀況,2009/12/04,狀態(tài)好的細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓清楚，分裂期細(xì)胞多見。 狀態(tài)差的細(xì)胞，失去原來的特點(diǎn)，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡、顆粒，細(xì)胞變形，出現(xiàn)死亡。 培養(yǎng)液澄清，培養(yǎng)液顏色在指示劑的反映下顯示為中性范圍。,（一）培養(yǎng)液的顏色和透明度,2009/12/04,（二）培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察,1

32、、常規(guī)采用倒置顯微鏡觀察，最基本有兩種形態(tài)：,2009/12/04,倒置顯微鏡,2009/12/04,2009/12/04,上皮細(xì)胞型,來源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞，如皮膚、乳腺、肝、肺泡、消化道上皮、形態(tài)為扁平的多角型、胞質(zhì)近中有圓形細(xì)胞核，生長特點(diǎn)為細(xì)胞之間緊密相靠，互相銜接，具有連成片的能力。,2009/12/04,成纖維細(xì)胞型,來源于中胚層的細(xì)胞，如纖維結(jié)締組織，平滑肌、心肌，血管內(nèi)皮細(xì)胞，形態(tài)具有長短不等的數(shù)個細(xì)胞突起，成棱形、不規(guī)則三角型。核為卵圓形，位于靠近胞質(zhì)的中央，。生長特點(diǎn)為細(xì)胞排列為漩渦狀、放射狀、或柵欄狀。,2009/12/04,相差顯微鏡 把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅

33、差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。 環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。 相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。,2、活細(xì)胞的觀察,2010/11/29,(三)細(xì)胞生長狀況的觀察,2009/12/04,1、細(xì)胞計數(shù),它是了解細(xì)胞生長狀態(tài)的量化指標(biāo) 制備細(xì)胞懸液，密度不低于10000細(xì)胞ml，用10物鏡觀察計數(shù)板四角大方格的細(xì)胞數(shù)。 計數(shù)：細(xì)胞數(shù)ml原液（4大格細(xì)胞數(shù)之和4）10000 注意要點(diǎn)：細(xì)胞分散均勻

34、制成單個細(xì)胞懸液；計數(shù)時數(shù)上不數(shù)下；數(shù)左不數(shù)右。,2009/12/04,一個血球計數(shù)器含有兩個chamber。每一chamber中有九個1mm2的大方格 ，且chamber高度為0.1mm，所以每一個大方格的體積為0.1mm3。,2009/12/04,細(xì)胞多于1000個/mm3,2009/12/04,2、培養(yǎng)細(xì)胞活力測定,任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從 形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。 在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì) 胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離 細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否 有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍

35、存和 復(fù)蘇的效果。,2009/12/04,2、培養(yǎng)細(xì)胞活力測定-臺盼藍(lán)法,活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色； 用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力； 方法： 1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中； 2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘； 3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片； 4、鏡下取幾個任意視野分別計死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計細(xì)胞活力； 死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染 色，鏡下呈無色透明狀。 活力測定可以和細(xì)胞計數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。,2009/12/04,培養(yǎng)細(xì)胞活力測定-伊紅Y(Eosin Y),細(xì)胞懸液與7倍量

36、的0.15%伊紅Y染液（生理鹽水配制）混合2分鐘后鏡檢，死細(xì)胞為桃紅色。,2009/12/04,2、細(xì)胞活力測定-MTT比色法,四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)， 四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值 MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。,2009/12/04,（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升

37、（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間） （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時。 （3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。 （4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長為570 nm）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線,操作步驟,2009/12/04,（四）細(xì)胞污染觀察與防治,CELL CULTURE CONTAMINATION,2009/12/04,凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染 細(xì)胞污染不能完全被消除，但能減少其

38、發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性,2009/12/04,細(xì)胞污染的分類 物理污染 化學(xué)污染 生物污染（支原體污染）,控制污染 掌握良好的無菌操作技術(shù) 建立細(xì)胞庫 合理應(yīng)用抗生素 保持工作區(qū)清潔 建立良好的規(guī)章制度 檢測細(xì)胞污染,2009/12/04,溫度 孵箱放在溫度較恒定的房間中 培養(yǎng)液從冰箱取出后在室溫放置 放射線 試劑周圍不能放同位素 振動 孵箱周圍不能放引起振動的設(shè)備 輻射 試劑不要放在帶有玻璃門的冰箱中,物 理 污 染,Physical contamination,2009/12/04,化學(xué)污染 血清 培養(yǎng)液及試劑 水 培養(yǎng)用器皿 孵箱,chemical contamination,2009

39、/12/04,chemical contamination,培養(yǎng)液及試劑 選用純度最高的試劑 經(jīng)過權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)定 正確的儲存方法,血清 新購買的血清用之前要試 應(yīng)選用同一批次的血清,2009/12/04,實(shí)驗(yàn)試劑：縮寫為LR，又稱四級試劑。 化學(xué)純試劑：縮寫為CP，又稱三級試劑，一般瓶上用深藍(lán)色標(biāo)簽。 分析純試劑：縮寫為AR，又稱二級試劑，一般瓶上用紅色標(biāo)簽。 保證試劑：縮寫為GR，又稱一級試劑，一般瓶上用綠色標(biāo)簽（又稱優(yōu)級純）,2009/12/04,水 用來配液和清洗容器 傳統(tǒng)用雙蒸和三蒸水 現(xiàn)在用純水儀millipore 超純水放置過久純度下降,chemical contamination,

40、2009/12/04,容器 生產(chǎn)過程中有毒物質(zhì)殘留 消毒劑和清洗劑的殘留 鋁箔和包裹紙殘留,chemical contamination,孵箱 co2混有有毒氣體 消毒劑和清洗劑的殘留,2009/12/04,biological contamination,生物污染 外界的微生物如昆蟲、節(jié)肢動物、原蟲、霉菌、細(xì)菌、支原體和其它類型的細(xì)胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引起污染 容易發(fā)現(xiàn)的生物污染包括細(xì)菌、霉菌和酵母菌 不容易被發(fā)現(xiàn)的生物污染包括病毒、原蟲、昆蟲、支原體和其它細(xì)胞系,2009/12/04,biological contamination,對實(shí)驗(yàn)人員是一個潛在的危險因素 細(xì)胞系交叉污染 污染在這

41、是個錯誤的用詞 難于發(fā)現(xiàn) 若出現(xiàn)傳代細(xì)胞的生長速度異常，考慮交叉污染 同一時間只傳同一種細(xì)胞 每種細(xì)胞要有單獨(dú)的液體 建立細(xì)胞庫每三個月更換一次細(xì)胞 支原體污染,細(xì)菌、霉菌和酵母 無抗生素污染易被發(fā)現(xiàn) 抗生素存在易造成隱性污染 隱性污染引起嚴(yán)重后果,病毒 最難發(fā)現(xiàn)和清除 嚴(yán)格的宿主性 自限性,2010/11/29,細(xì)菌與真菌的污染,2009/12/04,細(xì)菌污染檢測 肉眼直接觀察法：培養(yǎng)液渾濁或細(xì)胞生長緩慢。 培養(yǎng)檢查法：用肉湯培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基37度培養(yǎng)待檢樣品數(shù)日，觀察肉湯培養(yǎng)基有無渾濁，或瓊脂培養(yǎng)基有無菌落形成。 顯微鏡觀察法：鏡下可見大量菌體,細(xì)菌與真菌的污染,2009/12/04,真

42、菌污染的檢測 肉眼直接觀察法：大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面 顯微鏡觀察法：鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯。念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵圓形。,細(xì)菌與霉菌的污染,2009/12/04,細(xì)菌與真菌的污染,常見污染的細(xì)菌有革蘭陰性菌如：大腸埃希菌、假單胞菌等；革蘭陽性菌有葡萄球菌、枯草桿菌等. 真菌污染常可發(fā)生，尤其炎熱、潮濕的季節(jié)十分常見，如煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子 苗等。 霉菌和細(xì)菌生長迅速，能在短時間內(nèi)抑制細(xì)胞生長，或產(chǎn)生有意物質(zhì)殺死細(xì)胞。鏡下可見腦漿內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒，細(xì)胞變圓或崩潰，從瓶壁脫落。,2009/12/04,霉菌污染容易發(fā)現(xiàn)，大多形成白色或淺黃色菌團(tuán)漂浮于培養(yǎng)液表面

43、，肉眼可見，有的散在生長，鏡下可見絲狀菌絲，縱橫交錯于細(xì)胞之間。,2009/12/04,常 見 真 菌 形 態(tài),2009/12/04,真菌污染的成纖維細(xì)胞,2009/12/04,白假絲酵母菌污染,2009/12/04,細(xì)菌污染如果較嚴(yán)重時培養(yǎng)基上清混濁，較輕時鏡下可見小的菌體在細(xì)胞間運(yùn)動，同時可涂片染色鏡檢或進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，加以確定。,2009/12/04,支原體（雜草）,biological contamination,2009/12/04,2009/12/04,支原體（雜草）,biological contamination,污染嚴(yán)重,難發(fā)現(xiàn) 難去除 顯微鏡看不到 不引起培養(yǎng)液渾濁和P

44、H改變 營養(yǎng)要求高不容易用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法檢測到 不能通過過濾清除 大多數(shù)抗生素對其無效,2009/12/04,支原體污染來源,人體的組織及體液成分是細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的主要來源。污染的細(xì)胞中通常能分離到人類口腔支原體、發(fā)酵支原體、唾液支原體以及其它一些與人有關(guān)的支原體，操作過程中，操作者能產(chǎn)生有污染性的隨空氣傳播的飛沫和微粒，造成培養(yǎng)體系的污染。 培養(yǎng)體系中支原體污染的最可能途徑是經(jīng)已被支原體污染的細(xì)胞擴(kuò)散和傳播。 牛血清中能分離到A.laidlawii、M.arginini和M.hyorhinis支原體，因此血清可能成為支原體污染的來源,2009/12/04,支原體污染危害,1）雜交瘤

45、技術(shù) 1融合細(xì)胞無分泌單抗的能力2雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗不是針對靶抗原，而是針對支原體3支原體消耗胸腺嘧啶，干擾HAT*篩選4在HAT篩選過程中喪失了雜交瘤細(xì)胞 2）細(xì)胞遺傳學(xué) 1造成羊水污染2姊妹染色單體交換增多3染色體隨機(jī)斷裂和畸變增多4產(chǎn)生額外的染色體5干擾羊水培養(yǎng)的結(jié)果6精子污染后受精能力下降7染色體數(shù)目減少,2009/12/04,3）病毒學(xué) 1轉(zhuǎn)錄酶活性下降2干擾某些逆轉(zhuǎn)錄病毒的分離3降低禽痘病毒的感染力及空斑的形態(tài)4誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生干擾素5抑制腺病毒的增殖6誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生干擾素7污染病毒疫苗8引起巨細(xì)胞病毒及帶狀病毒形成假空斑9降低腺病毒及SV40胸腺嘧啶的摻入10抑制腺病毒和

46、單純皰疹病毒的增殖11抑制脊髓灰質(zhì)炎病毒和牛痘病毒的增殖12支原體與病毒在蔗糖梯度離心中共沉淀13抑制新城病病毒（NDV）產(chǎn)生干擾素,支原體污染危害,2009/12/04,4）代謝 1降低鳥氨酸脫羧酶的產(chǎn)生2降低蛋白質(zhì)和RNA的產(chǎn)生3消耗培養(yǎng)液中的精氨酸4改變尿苷尿氨酸的比例5降低DNA和RNA的合成6增加胸腺嘧啶的降解7誘導(dǎo)3T3細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶8增加致癌物誘導(dǎo)芳香烴羥化酶的產(chǎn)生9促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的增殖10降低嘌呤替代途徑11降低ATP水平 5）生物反應(yīng)性 引起鼠的淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,支原體污染危害,2009/12/04,支原體污染檢測,由于支原體污染并不引起細(xì)胞外觀的明顯變化，故常規(guī)的支原體檢測

47、非常必要的。人們可利用一系列直接或間接的方法檢測支原體。但由于支原體種類的多樣性，目前還沒有一種方便、廣譜、特異性高、準(zhǔn)確的檢測方法。因此，有必要對不同檢測方法的靈敏度及局限性有所了解。,2009/12/04,支原體檢測方法,biological contamination,2009/12/04,直接培養(yǎng)法 是最敏感的，但也是最耗時的檢測方法，大約需28天。從理論上講，只需一個有活力的支原體就能在培養(yǎng)基上生長。但某些難以培養(yǎng)的支原體限制了直接培養(yǎng)法的應(yīng)用。直接培養(yǎng)法還需要活性支原體作為陽性對照，而且耗時，操作繁瑣，因而不適于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。,支原體檢測方法,2009/12/04,間接檢測法 包括

48、：PCR、ELISA、電子顯微鏡檢查、DNA探針、DNA熒光染色及生化分析法等。 間接法能檢測到107L的滴度。通常情況下，支原體污染后其滴度一般超過109L，故盡管間接法不敏感，但相對較精確。由于支原體的多樣性，表達(dá)不同特異性的抗原及酶，為生化及免疫檢測法帶來技術(shù)上的困難。在選擇PCR、DNA探針等方法前，應(yīng)考慮好選擇合適的靶序列及引物序列。,支原體檢測方法,2009/12/04,DNA熒光染色法,原理利用熒光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）檢測支原體污染。此染劑會結(jié)合到DNA的 (A-T) rich區(qū)域，因?yàn)橹гwDNA中A-T含量占多數(shù)（5580%），所以可

49、將其染色而得以檢測。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體的DNA，證明有支原體之污染。,2009/12/04,細(xì)胞DNA,支原體,DNA熒光染色法,2009/12/04,陽性,陰性,DNA熒光染色法,2009/12/04,2009/12/04,2009/12/04,DNA熒光染色法質(zhì)控與提示,（1）標(biāo)記的靶細(xì)胞除CKI1 和vero 細(xì)胞外，3T6 細(xì)胞（ARCCCCL96）也可使用。本法成功的要點(diǎn)之一是用作靶細(xì)胞質(zhì)控的管理應(yīng)嚴(yán)格，必預(yù)先確認(rèn)該細(xì)胞無支原體的污染才能凍存使用。 （2）要明確本檢體的結(jié)果判定，必須使用不含抗生素的培養(yǎng)液。 （3）

50、染色液：Hoechst 染液不穩(wěn)定，故每次檢測前須新鮮配制，使用DAPI 也可以，均應(yīng)新鮮配制。,2009/12/04,（4）試驗(yàn)檢體：被試細(xì)胞回收時用橡膠刮匙刮下，不能用胰蛋白酶等水解酶類消化，制備好的檢體細(xì)胞保存在80冰箱中可存放數(shù)月。 （5）陽性對照：本試驗(yàn)采用支原體M.hyorhinis 和M.orale 為陽性對照，要十分注意避免有新的污染源。,DNA熒光染色法質(zhì)控與提示,2009/12/04,（6）特異性與敏感性：本法不是支原體的特異性檢出法，對DNA 進(jìn)行染色觀察，對其他微生物（細(xì)胞內(nèi)寄生的霉菌、細(xì)菌等）的污染，也可看出同樣的熒光染色。本法針對這些支原體污染的檢出敏感度為1cfu

51、，而一般污染細(xì)胞中的支原體濃度為103108cfu/mL，故本法仍具有很好的實(shí)用性。,DNA熒光染色法質(zhì)控與提示,2009/12/04,DNA熒光染色法和直接培養(yǎng)法相結(jié)合是支原體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。美國、加拿大和歐共體國家生物制藥及診斷的監(jiān)督機(jī)構(gòu)推薦使用這種方法。其基本原理在于利用不同的技術(shù)，多次檢測，以彌補(bǔ)各種檢測技術(shù)的缺陷，增加檢測結(jié)果的可信度。,DNA熒光染色法質(zhì)控與提示,2009/12/04,PCR kit - Fisher, Strategene, Sigma,2009/12/04,分子量對照 2 陰性對照 3-8 原有細(xì)胞的懸液 9 陽性對照,VenorGeM試劑盒,2009/12/04

52、,細(xì)胞系交叉污染,2009/12/04,細(xì)胞系交叉污染,2009/12/04,biological contamination,樹 立 “預(yù) 防 為 主” 的 思 想,保證細(xì)胞來源干凈 確?；|(zhì)和器材無菌 嚴(yán)格無菌操作 細(xì)胞培養(yǎng)時避免交談 操作結(jié)束時消毒臺面 每傳15代的細(xì)胞應(yīng)更換 所有細(xì)胞培養(yǎng)材料丟棄前應(yīng)高壓消毒,2009/12/04,control contamination,良好的無菌操作,合理利用抗生素,建立細(xì)胞庫,保持工作區(qū)清潔,良好的規(guī)章制度,細(xì)胞污染的檢測,2009/12/04,良好的無菌操作 所有玻璃器皿和培養(yǎng)液與試劑的配制應(yīng)嚴(yán)格無菌 避免溢出、濺出和氣溶膠； 吸入或吸出液體時

53、避免傾倒； 吸入或吸出液體時，不要觸碰細(xì)胞培養(yǎng)瓶的瓶口； 液體應(yīng)分裝并置4-8oC保存； 每種細(xì)胞應(yīng)使用單獨(dú)的液體； 清潔區(qū)和污染區(qū)的材料應(yīng)單獨(dú)處理；,control contamination,2009/12/04,合理利用抗生素 過度依賴抗生素會使人們忽略無菌操作 濫用抗生素常導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生 牢記抗生素不能代替無菌操作,control contamination,2009/12/04,建立細(xì)胞庫 減少從主管單位獲得細(xì)胞的運(yùn)輸費(fèi) 凍存的細(xì)胞生物性狀不發(fā)生改變 消除了隱蔽污染的潛在危害,control contamination,2009/12/04,2009/12/04,良好的規(guī)章制度 只

54、有相關(guān)人員才可進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)區(qū) 細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)必須和其他區(qū)域分開 每個細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)應(yīng)布局合理，保證所需物品就近放置，在處理細(xì)胞時避免不必要的走動 細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)應(yīng)避免使用水池，從而避免微生物污染,control contamination,2009/12/04,control contamination,保持工作區(qū)清潔,常規(guī)清洗地面和臺面,CO2孵箱 每2-3個月消毒清洗孵箱 所有濺出或溢出的液滴應(yīng)立即擦拭并消毒 每周孵箱內(nèi)水盤需徹底消毒清洗,定期清潔水浴箱,生物安全柜 每次使用后應(yīng)清潔和消毒安全柜的內(nèi)表面 定期消毒安全柜工作面下層的盤子；,及時清理廢棄物，高壓感染材料,2009/12/04,contro

55、l contamination,細(xì)胞污染的檢測,支原體的檢測,其它生物污染的檢測 使用傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測方法,化學(xué)污染的檢測 常被誤認(rèn)為生物污染 要靠逐一替換的方法確定化學(xué)污染的來源,2009/12/04,1）使用抗生素 抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。 聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。 預(yù)防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100g/mL)，污染后清除用藥需采用大于常用量510倍的沖洗。,control contamination,2009/12/04,1）使用抗生素 支原體污染用藥(大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類） Myco-1(A5222) 泰妙菌素是一種雙萜類動物專用抗生素，對革蘭氏陽性菌、支原體等有較強(qiáng)的抗菌作用。先用Applichem的Myco-1連續(xù)處理4天后換Myco-2處理3天，如此重復(fù)2-3次即可完全清除細(xì)胞內(nèi)的支原體污染。Myco-2(A5219) 米諾環(huán)素(鹽酸二甲胺四環(huán)素，美滿霉素)，其抗菌譜與四環(huán)素相似，但是對于支原體的抑制效果更