1、PCR技術原理、實驗步驟和應用來源：易生物實驗瀏覽次數(shù)：3623網(wǎng)友評論0條PCR技術，即聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）是由美國PECetus公司的KaryMullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立的。這項技術可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應就將特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。關鍵詞：PCR技術PCR聚合酶鏈反應一、實驗目的1.掌握聚合酶鏈式反應的原理。2. 掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術。二、實驗原理PCR技術，即聚合酶鏈反應（polymer

2、ase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立的。這項技術可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應就將特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是DNA分析最常用的技術，而且在DNA重組與表達、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應用價值。PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內(nèi)的DNA復制過程相似的技術，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是

3、在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內(nèi)DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應做準備；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。重復循環(huán)變性-退火-延伸三

4、過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。三、實驗試劑與器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaqDNA聚合酶（5U/L）、SSR引物10 buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR儀、移液槍、PCR板四、實驗步驟1、配制20L反應體系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2L引物1 1L引物2 1L dNTP 1.5L MgCl22L 10buffer 2LddH2O 10LTaq酶 0.5LPCR擴增產(chǎn)物 可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中， 以兩條互補的DNA為模板，引物是從3端開始延伸， 其5端是固定的，3 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)時， 由于新鏈模板的5端序列是固定的， 這就等于這次延伸的片段3端被固定了止點， 保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“