1、1,第十八章平面色譜法 (plane chromatography),在平面上進行分離的一種色譜方法，主要包括薄層色譜法和紙色譜法。 紙色譜法 薄層色譜法,2,第一節(jié)平面色譜法的分類和原理,分類 薄層色譜法： 吸附薄層色譜法 分配薄層色譜法 分子排阻薄層色譜法 紙色譜法:分配 薄層電泳法,3,平面色譜法參數(shù),定性參數(shù) 相平衡參數(shù) 面效參數(shù) 分離參數(shù),4,定性參數(shù)1,比移值(Rf值) 溶質(zhì)移動距離與流動相移動距離之比。（速度之比？） Rf =L/L0 （定時展開） L為原點（origin）至斑點中心的距離，L0為原點至溶劑前沿（solvent front）的距離 與組分及色譜條件有關(guān),5,定性參

2、數(shù)2,相對比移值(relative Rf；Rr) Rr = Rf (i)/Rf (s)=L(i)/L(s) 與組分、色譜條件、參考物質(zhì)有關(guān)。 Rr值可以大于1，也可以小于1。 重現(xiàn)性和可比性均比Rf值好，能消除系統(tǒng)誤差（參考物質(zhì)與組分在完全相同的條件下展開）,6,相平衡參數(shù),分配系數(shù)K= Cs/Cm 容量因子 k= CsVs/CmVm K、k與Rf值的關(guān)系：,7,相平衡參數(shù),K、k與Rf值關(guān)系推導： (與定距展開比較) Rf =L/L0=u/u0=R= R為保留比,8,第二節(jié)薄層色譜法 (thin layer chromatography；TLC),固定相（吸附劑或載體）涂布成一均勻薄層，點樣

3、，（密閉的容器中）展開，斑點顯色，（與對照物質(zhì)）比較進行定性定量。,9,特點： 快，需十至幾十分鐘，同時展開多個試樣。 試樣預處理簡單，對試樣限制少。 載樣量比較大，適用于制備。 儀器簡單，操作方便。 分離能力較強。 靈敏度較高。,10,一、薄層色譜法的主要類型和原理,吸附薄層色譜法 原理：組分在薄層板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的過程。 吸附系數(shù)不等實現(xiàn)分離。 一般極性強的組分K大，Rf值??；極性弱的組分 K小，Rf值大。,11,薄層色譜法的主要類型和原理,分配薄層色譜法 原理：多次分配的過程，分配系數(shù)（溶解度）不等實現(xiàn)分離 分類：正相色譜、反相色譜,12,薄層色譜法的主要類型和原理,分

4、配薄層色譜法 正相色譜：水為固定相（硅膠載體），有機溶劑為流動相。 極性強的組分K大， Rf值小。 反相色譜：烷基化學鍵合相為固定相，水有機溶劑為流動相。 極性強的組分K小， Rf值大。,13,二、吸附薄層色譜的吸附劑和展開劑,吸附劑 硅膠：多孔性微粒，表面帶有硅醇基，呈弱酸性。 原理：硅醇基(吸附中心)與極性基團形成氫鍵（吸附性）。 組分與硅醇基形成氫鍵（被吸附）的能力不同而分離。 應用：酸性和中性物質(zhì)的分離，如有機酸酚類、醛類等,14,硅膠 活度與含水量的關(guān)系：含水量高，活性級高，活度低。 活化：加熱至100左右，除去吸附水提高活度。（注意溫度不可過高） 分離效率：與其粒度、孔徑及表面積等

5、有關(guān)。 常用硅膠： 硅膠H，不含黏合劑 硅膠G，含煅石膏 硅膠GF254，含煅石膏和一種無機熒光劑，即錳激活的硅酸鋅，在254nm紫外光下呈強烈黃綠色熒光背景。,15,吸附劑 氧化鋁 堿性氧化鋁(pH9.0)分離中性或堿性化合物，如生物堿、脂溶性維生素等； 中性氧化鋁(pH7.5)分離酸性及對堿不穩(wěn)定的化合物； 酸性氧化鋁(pH4.0)酸性化合物的分離。 活度也與含水量有關(guān)。,16,展開劑(流動相) 同吸附柱色譜 極性強的溶劑洗脫能力強 常用溶劑的極性強弱順序： 水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳環(huán)己烷石油醚。,17,展開劑 選擇原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的極性

6、 Stahl簡圖：極性物質(zhì)活度低（活性級大）的吸附劑-極性展開劑,18,展開劑 混合溶劑 先用單一溶劑展開， 若Rf值太小，則加入一定量極性強的溶劑，如乙醇、丙酮等， 如果Rf值太大，則加入適量極性弱的溶劑(如環(huán)己烷、石油醚等)，以降低極性。 可加入一定比例的酸或堿,使斑點集中。,19,三、薄層色譜操作方法,制板均勻 點樣集中 展開(多種方式) 預飽和 顯色 自學，實驗課講,20,四、定性和定量分析,定性分析 比較Rf值或Rr值 、斑點顏色或熒光 常采用已知標準物質(zhì)對照（同一板上展開） 多種展開系統(tǒng)的Rf值與對照品一致。 定量分析 洗脫法 直接定量法 1.目視比較法（如雜質(zhì)限度檢查方法） 2.

7、薄層掃描法,21,第三節(jié)紙色譜法,一、紙色譜法的分離原理 紙纖維為載體，吸著在其上的水為固定相 屬于正相分配色譜 依據(jù)分配系數(shù)的不同而達到分離 極性或親水性強的組分，K大，Rf值小，極性弱或親脂性強的組分，K小，Rf值大。 極性強弱？例：三個六碳糖,22,二、紙色譜法的實驗條件,色譜紙的選擇 對Rf值相差很小的化合物，宜采用慢速濾紙 對Rf值相差較大的化合物，則可用快速濾紙 固定相 水或甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇或緩沖溶液。（酸、堿）,23,紙色譜法的實驗條件,展開劑的選擇增加展開劑中極性溶劑的比例量，可以增大Rf值；增加展開劑中非極性溶劑的比例量，可以減少Rf值。 常用的展開劑水飽和的有機

8、溶劑，如水飽和的正丁醇、正戊醇、酚等 操作步驟 點樣、展開、顯色、定性定量分析,24,主要內(nèi)容：,比移值及其與K和k的關(guān)系、相對比移值 吸附薄層色譜法：原理，吸附劑、展開劑及其選擇 薄層色譜定性方法 紙色譜法：原理和實驗條件,25,第十九章 氣相色譜法gas chromatography，GC,分析化學教研室 李發(fā)美教授,26,發(fā)展 英國Martin等人于1941年首次提出了用氣體作流動相； 1952年第一次用氣相色譜法分離測定復雜混合物； 1955年第一臺商品氣相色譜儀； 近年電子計算機技術(shù)。,27,第一節(jié) 氣相色譜法的分類和一般流程,一、分類 按固定相的聚集狀態(tài): GSC、GLC 按分離原

9、理： GSC屬于吸附色譜，GLC屬于 分配色譜。 按色譜操作形式：柱色譜（分填充柱色譜 毛細管柱色譜）,28,二、特點： 高效能：neff可達103106 高選擇性：特別復雜試樣 高靈敏度：可以檢測10111013g物質(zhì) 分析速度快、操作簡單：色譜操作及數(shù)據(jù)處理自動化 應用廣泛：氣體和易揮發(fā)或可衍生化為氣體 弱點：受試樣蒸氣壓限制和定性困難。,29,三、氣相色譜法的一般流程,30,載氣系統(tǒng)（carrier gas system）,色譜柱系統(tǒng)（column system）,檢測系統(tǒng)（detection system）,記錄系統(tǒng)（data system）,進樣系統(tǒng)（sample injection

10、 system）,31,第二節(jié) 氣相色譜固定相和流動相,一、氣液色譜固定相 對固定液的要求,在操作溫度下蒸氣壓要低； 穩(wěn)定性好； 對被分離組分的選擇性要高； 對試樣中各組分有足夠的溶解能力。,32,固定液的分類,化學分類：依據(jù)結(jié)構(gòu)分類 烴類：烷烴與芳烴，角鯊烷（異卅烷、C30H62) ，標準非極性固定液。 硅氧烷類：甲基、苯基、氰基、氟硅氧烷等，最通用 聚醇：如聚乙二醇PEG20M ，氫鍵型 聚酯：丁二酸二乙二醇聚酯 ( PDEGS或DEGS),33,極性分類,用相對極性 P 來表示,q1(lgr1) : 苯與環(huán)己烷在,-氧二丙腈柱上的相對保留值的對數(shù)。 q2 (lgr2) : 角鯊烷柱上的相

11、對保留值的對數(shù)。 qx (lgrx) : 在待測柱上的相對保留值的對數(shù)。,34,相對極性Px分類： , -氧二丙腈：P =100 角鯊烷： P =0 其余：Px=0-100 分為5級 0200或1非和弱極性 角鯊烷、甲基硅橡膠 21402中等極性 DNP、OV-17 41603中等極性 氰基硅橡膠 61804極性 聚乙二醇 811005極性 , -氧二丙腈,35,麥氏常數(shù)分類法: 以物質(zhì)m在待測固定液和非極性固定液 (通常是沙魚烷) 中的保留指數(shù)之差值作為該固定液相對極性強弱的度量,36,保留指數(shù) (I) ：,用保留時間緊鄰待測組分的兩個正構(gòu)烷烴來標定組分的相對保留值，又稱Kovats指數(shù),I

12、x為待測組分的保留指數(shù)， z與z+n為正構(gòu)烷烴對的碳原子數(shù)。 規(guī)定正己烷、正庚烷及正辛烷為600、700及800,37,例 在Apiezon L柱上，柱溫100，用正庚烷及正辛烷為參考物質(zhì)對，測得t0=30.0，正庚烷的tR=204.0，乙酸正丁酯的tR=340.0及正辛烷的tR=403.4。,說明乙酸正丁酯在Apiezon L柱上的保留行為相當于7.756個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留行為。,Ix=100（,）=775.6,38,麥氏常數(shù),苯、丁醇、戊酮-2、硝基丙烷、吡啶五種物質(zhì)在被測固定液與角鯊烷柱上保留指數(shù)的差值,分別以x ，y，z ，u，s 表示. 苯: I=I被測I角鯊烷= x 代表不同

13、類型的作用力， 這五個I以及它們的平均值，可以作為固定液極性的標度。其值越大，極性越強。,39,固定液的選擇相似性原則,40,固定液的選擇主要差別,組分極性差別較大：選用極性固定液。 沸點差別較大：選用非極性固定液。 例：苯與環(huán)己烷 (苯80.1，環(huán)己烷80.7) 。苯為弱極性，環(huán)己烷為非極性，極性差別是主要矛盾。 非極性固定液很難分開。 中等極性的固定液，如用鄰苯二甲酸二壬酯，則苯的保留時間是環(huán)己烷的1.5倍。,41,固定液的選擇麥氏常數(shù),根據(jù)作用力 例 正丁基乙基醚中雜質(zhì)正丙醇的檢查。希望正丙醇先出。醚是質(zhì)子受體，醇是質(zhì)子給體， z 值越大，固定液對質(zhì)子受體（戊酮-2）的作用力越強，y值越

14、小，固定液對質(zhì)子給體（丁醇）作用力越弱。 應選擇z 值大于y值，即具有高z /y值的固定液。,42,載體（擔體）,要求：,表面積大，孔徑分布均勻； 表面吸附性很弱； 熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性好； 粒度均勻，有一定的機械強度。,硅藻土型載體 紅色載體 常與非極性固定液配伍 白色載體 常與極性固定液配伍,43,除去載體表面的鐵等金屬氧化物。 用于分析酸性化合物。,將載體與硅烷化試劑反應，除去載體表面的硅醇基。 分析形成氫鍵能力較強的化合物。,酸洗法,堿洗法,硅烷化法,除去載體表面的Al2O3等酸性作用點。 用于分析胺類等堿性化合物。,載體的鈍化,44,二、氣固色譜固定相,吸附劑、分子篩、高分子多孔微球

15、及化學鍵合相等 高分子多孔微球（GDX） -具有吸附、分配及分子篩三種作用 耐高溫，最高使用溫度為200300； 峰形好，一般不拖尾； 無柱流失現(xiàn)象，柱壽命長； 一般按分子量順序分離的特點,45,三、流動相（載氣）,氫氣 氮氣,分子量小，熱導系數(shù)大，粘度小。 常用于熱導檢測器。,要求：純度在99.99%以上、凈化 選擇：主要取決于檢測器、色譜柱及分析要求。,擴散系數(shù)小，柱效比較高。 除熱導檢測器以外的其它幾種檢測器中，多采用氮氣作載氣。,46,第三節(jié) 檢測器,將流動相中組分的濃度或量信號轉(zhuǎn)變成電信號。,濃度型檢測器：測量載氣中組分濃度的變化 熱導檢測器、電子捕獲檢測器等。,質(zhì)量型檢測器：測量組

16、分進入檢測器的質(zhì)量流速 變化?；鹧骐x子化檢測器、火焰光度檢測器等。,或,47,一、檢測器的性能指標,靈敏度（sensitivity） 濃度型檢測器Sc ：為1ml載氣攜帶1mg的某組分通過檢測器時，產(chǎn)生的電壓，Vml/mg； 質(zhì)量型檢測器Sm：每秒有1g的某組分被載氣攜帶通過檢測器，產(chǎn)生的電壓或電流值，mVs/g或As/g。,48,噪音（noise；N）和漂移（drift；d）,49,檢測器的性能指標,檢測限（detectability；D） 某組分的峰高恰為噪音的兩倍（2N）時，單位時間內(nèi)載氣引入檢測器中該組分的質(zhì)量（g/s），或單位體積載氣中所含該組分的量（mg/ml）。 D=2N/S 檢

17、測限越小，檢測器的性能越好。,50,常用檢測器 熱導檢測器（thermal conductivity detector；TCD） 氫焰離子化檢測器（hydrogen flame ionization detector；FID） 電子捕獲檢測器（electron capture detector；ECD） 火焰光度檢測器(flame photometric detector；FPD) 熱離子化檢測器(thermionic ionization detector；TID),51,二、熱導檢測器（thermal conductivity detector；TCD）,測定原理： 利用組分與載氣的熱導率

18、之差 構(gòu)造：,52,熱導檢測器,有組分進入測量臂,若,則,IG取決,53,熱導檢測器,熱導率：(x102) H2 22.36 He 17.42 N2 3.14 甲烷 4.56 乙醇 2.22,54,熱導檢測器,注意 常用氫氣作載氣， 不能載氣勿加橋電流； 盡量采用低電流； 濃度型檢測器，峰面積定量時，需保持流速恒定。,55,熱導檢測器,優(yōu)點: 結(jié)構(gòu)簡單、適用范圍廣（無機物，有機物），不破壞樣品。 缺點: 靈敏度低，噪音大。,56,三、氫焰離子化檢測器（hydrogen flame ionization detector；FID）,測定原理 測定有機物在氫火焰的作用下，化學電離形成的離子流的強度

19、。,57,氫焰離子化檢測器,在高溫火焰作用下，有機物組分電離成正負離子，在收集極（正極）和極化極（負極）外電場作用下定向運動而形成離子流（電流）。放大后被檢測。 離子流強度決定于： 電離的程度-被測組分的性質(zhì)， 進入離子室的被測組分的量,58,氫焰離子化檢測器,注意 氣體及流量：燃氣用氫氣，空氣作為助燃氣，載氣用氮氣。流量關(guān)系一般為，N2:H2:Air為1:11.5:10。 質(zhì)量型檢測器：用峰高定量時，需保持載氣流速恒定。,59,氫焰離子化檢測器,優(yōu)點：靈敏度高，噪音小，死體積小等 缺點：破壞樣品，一般只能測定含碳化 合物。,60,四、電子捕獲檢測器,結(jié)構(gòu) 測定原理 N2 + e AB + e

20、 AB + E,61,62,第四節(jié) 分離條件的選擇,一、氣相色譜速率理論 H = A + B/u + Cu,63,氣相色譜速率理論,渦流擴散項（eddy diffusion）A A=2dp 粒度較細，顆粒均勻， 一般為6080目或80100目的填料。 填充均勻。 空心毛細管柱無多徑項，A=0。,64,氣相色譜速率理論,分子擴散項（molecular diffusion） B/u B=2Dg 1、 填充柱1 ，硅藻土 為0.50.7 空心毛細管柱1,65,氣相色譜速率理論,2、Dg 與組分的性質(zhì)有關(guān)。 與載氣的分子量（M）的平方根成反比， 隨柱溫（T）升高而增大， 隨柱壓（P）增大而減小。 因此

21、采用 載氣線速度較低時用氮氣，較高時宜用氦氣或氫氣。 較低的柱溫。 3、u 用較高的載氣流速。,66,氣相色譜速率理論,傳質(zhì)阻抗項（mass transfer resistance）Cu=(Cg+Cl)u 填充柱：Cg很小，忽略不計，故CCl,67,氣相色譜速率理論,df，固定相的液膜厚度要薄 D1，組分在液相中的擴散系數(shù)要大 U：,68,氣相色譜中影響柱效的因素： 柱填充的均勻程度 載體的粒度，表面無深孔 固定液的液膜厚度（氣液） 載氣的流速和種類 柱溫,氣相色譜速率理論,69,二、實驗條件的選擇,分離方程式：,a為柱效項：柱性能 b為柱選擇性項：=K2/K1=k2/k1 ，固定液 c為柱容

22、量因子項 ：柱溫、固定液量、K,a b c,70,實驗條件的選擇,n、k 對分離度的影響,71,如何獲得滿意的分離度？,72,（一）提高和適當k,固定液的選擇： 分配系數(shù)比（選擇性）及容量因子： 固定液種類。原則？極性、最高使用溫度。 容量因子k： 固定液的用量、分配系數(shù)、柱溫，k要適當。,73,（二）提高n,載氣流速和種類 的選擇,流速0u最佳：選用分子量較大的載氣，如N2、Ar uu最佳 ：選用分子量較小的氣體， 如H2、He,線速度：稍高于最佳流速。,74,提高n,柱溫的選擇： TC ： K ， 不利 Dg ，不利 Dl ， Cl 有利,75,提高n,柱溫的選擇： 選擇原則： 不超過固定

23、液最高使用溫度； 在良好分離，分析時間適宜，不拖尾的前提下，盡可能采用低柱溫。 高沸點混合物：低于沸點100150，低固定液配比（1%3%） 沸點300的試樣：比平均沸點低50至平均沸點,76,寬沸程試樣： 程序升溫，改善分離效果，縮短分析時間，提高靈敏度。,77,提高n,柱長和內(nèi)徑的選擇： 在達到一定分離度的條件下，應使用盡可能短的柱。,78,其他條件的選擇： 氣化室溫度：等于或稍高于試樣的沸點，不超過沸點50以上，高于柱溫3050。 檢測室溫度：高于至少等于柱溫。 進樣時間和進樣量：進樣速度快，在1s以內(nèi)。試樣不超載。,79,第六節(jié)定性與定量分析,一、定性分析方法 已知物對照法 保留值、加

24、樣、雙柱定性 利用相對保留值定性 利用保留指數(shù)定性 官能團分類測定法 兩譜聯(lián)用定性,80,二、定量分析方法,定量分析的依據(jù)： 在恒定的實驗條件下，峰面積（或峰高）與組分的（含）量成正比。 但，同一檢測器對不同物質(zhì)具有不同的響應靈敏度。,81,二、定量分析方法,（一）定量校正因子 絕對（重量）校正因子 單位峰面積（或峰高）所代表的物質(zhì)的質(zhì)量。 其值隨實驗條件而變化。,82,相對（重量）校正因子：fi 物質(zhì)i和標準物質(zhì)s的絕對校正因子之比。 標準物質(zhì):苯、正庚烷 測定法：準確稱取物質(zhì)i和標準物質(zhì)s，混勻，進樣，測得峰面積。 注意：實驗條件的一致。,83,（二）定量方法,歸一化法 樣品所有組分都產(chǎn)生

25、色譜峰 校正因子相等時，直接用峰面積。,84,歸一化法 優(yōu)點：簡便、定量結(jié)果與進樣量無關(guān)、受操作條件變化影響較小。 缺點：必須所有組分在一個分析周期內(nèi)都能流出色譜柱，檢測器對它們都產(chǎn)生信號。不適用于微量雜質(zhì)的測定。 例：甲醇、乙醇、正丙醇,85,（二）定量方法,外標法： 校正曲線： 用對照品配成不同濃度的對照液，定量進樣，用峰面積對對照品的量（或濃度）作線性回歸，求出斜率、截距，而后計算樣品的含量。,86,外標法： 校正曲線截距近似零時， 外標一點法：用一種濃度對照溶液 優(yōu)點：簡便，不用校正因子，不必加內(nèi)標物 只需待測組分出峰。 缺點：結(jié)果的準確度與進樣量的重復性和操作條件的穩(wěn)定性有關(guān)。,87

26、,（二）定量方法,內(nèi)標法： 以一定量的純物質(zhì)（內(nèi)標物），加入到準確稱定的試樣中，根據(jù)試樣和內(nèi)標物的重量及其峰面積比，求出某組分的含量。,88,內(nèi)標法： 優(yōu)點：只需內(nèi)標物及欲測組分出峰，操作條件變化而引起的誤差小。 缺點：內(nèi)標物選擇難 內(nèi)標物的選擇： 應是試樣中不存在的純物質(zhì)； 色譜峰位于被測組分色譜峰附近，或幾個被測組分色譜峰中間，并完全分離。,89,（二）定量方法,內(nèi)標校正曲線法： 一系列不同濃度的對照液，并加入相同量的內(nèi)標物，測Ai和As，以Ai/As對對照溶液濃度作圖。求出斜率、截距后。 試樣液也加入與對照液相同量的內(nèi)標物，測得Ai/As。 計算試樣的含量。,90,（二）定量方法,內(nèi)標對

27、比法（內(nèi)標一點法）：,91,主要內(nèi)容,固定液的分類和選擇 檢測器的性能指標 熱導、氫焰檢測器的原理和注意事項 速率理論和實驗條件的選擇 定量分析方法,92,第二十章高效液相色譜法 high performance liquid chromatography；HPLC,分析化學教研室李發(fā)美教授,93,經(jīng)典液相色譜法為基礎， 引入氣相色譜法的理論和實驗技術(shù)， 高壓輸送流動相， 高效固定相及高靈敏度檢測器， 現(xiàn)代液相色譜分析方法。,94,與經(jīng)典液相色譜法相比,顆粒極細（一般為10m以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高； 高壓輸液泵輸送流動相，流速快，分析速度快； 高靈敏

28、度檢測器，靈敏度大大提高。紫外檢測器最小檢測限可達109g，而熒光檢測器最小檢測限可達1012g。,95,與氣相色譜法相比,不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應用范圍廣； 可選用各種溶劑作為流動相，對分離的選擇性有很大作用，選擇性高； 一般在室溫條件下進行分離，不需要高柱溫。,96,第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型和原理,一、主要類型 四類基本類型色譜法 分配色譜法（partition chromatography） 吸附色譜法（adsorption chromatography） 離子交換色譜法（IEC） 空間排阻色譜法（SEC）,97,第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型和原理,一、主要類型

29、四類基本類型色譜法 分配色譜法（partition chromatography） 吸附色譜法（adsorption chromatography） 離子交換色譜法（IEC） 空間排阻色譜法（SEC） 化學鍵合相色譜法,98,其他色譜類型 親合色譜法（affinity chromatography；AC） 手性色譜法（chiral chromatography；CC） 膠束色譜法（micellar chromatography；MC） 電色譜法（electrochromatography；EC）,99,二、化學鍵合相色譜法,以化學鍵合相為固定相的色譜法，簡稱鍵合相色譜法(bonded phas

30、e chromatography；BPC) 化學鍵合相：采用化學反應的方法將官能團鍵合在載體表面所形成的固定相,100,優(yōu)點： 固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使用過程中不易流失，使用周期長； 柱效高；重現(xiàn)性好； 能使用的流動相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高 正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）鍵合相色譜法： 根據(jù)化學鍵合相與流動相極性的相對強弱,101,（一）正相鍵合相色譜法,固定相：極性鍵合相 如氰基（CN）、氨基（NH2）或二羥基鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠） 流動相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑 如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑） 適用范

31、圍：溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物 如一些在硅膠柱上分離的物質(zhì),102,正相鍵合相色譜法,分離機制？ 分配：把有機鍵合層作為一個液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解 吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團間的誘導、氫鍵和定向作用 分離選擇性： 極性強的組分k大，后洗脫出柱。 流動相的極性增強，洗脫能力增加，使組分k減小，tR 減小。,103,（二）反相鍵合相色譜法,固定相：非極性鍵合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠 流動相：水為基礎溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)整劑 常用甲醇水、乙腈水等 應用：最廣。非極性至中等極性的組分，（還有有機酸、堿及鹽等）,104,保留機制 疏溶劑理

32、論（solvophobic theory）,溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。 不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力，,105,反相鍵合相色譜法,保留行為的主要影響因素 1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性） 極性越弱，疏水性越強，k越大，tR也越大。 同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大； 引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。 2、固定相 鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增加，溶質(zhì)的k也增大。 硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)的k越大。,106,反相鍵合相色譜法,保留行為的主要影響因素 3、流動相 極性越強，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大 溶劑種類：水為弱溶

33、劑，醇為強溶劑 溶劑比例：水的比例增加，使k增大 中性鹽的加入：使中性溶質(zhì)的k增大 pH：影響弱酸、弱減的離解 流動相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小。,107,離子抑制色譜法（ion suppression chromatography；ISC ） 用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動相的pH，抑制有機弱酸、弱堿的離解，增加疏水締合作用，使k變大。 適用于3pKa7的弱酸、7pKa8的弱堿,反相鍵合相色譜法,108,把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（counter ion）生成中性離子對，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。

34、,（三）反相離子對色譜法 paired ionchromatography；PIC ion pair chromatography；IPC,109,反相離子對色譜法,離子對模型,3,3,+,+,(,),+,3,s,3,(,+,固定相,+,(,),+,B,),+,流動相,通式,110,影響容量因子的因素,離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的k增大 流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的k值最大 固定相 、流動相性質(zhì)（同一般RP-HPLC）。,111,適用范圍：有機酸、堿、鹽，離子型和非離子型化合物的混合物。 分析酸類

35、或帶負電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）等 分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）、,適用范圍和離子對試劑的選擇,112,第二節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動相及其選擇,固定相應符合下列要求： 顆粒細且均勻； 傳質(zhì)快； 機械強度高，能耐高壓； 化學穩(wěn)定性好，不與流動相發(fā)生化學反應。,113,一、化學鍵合相色譜法的固定相,（一）鍵合相的種類 非極性鍵合相 ： 非極性烴基，如C18C8C1與苯基等鍵合在硅膠表面； 用于反相色譜； 長鏈烷基可使溶質(zhì)的k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩(wěn)定性

36、更好。,114,鍵合相的種類,弱極性鍵合相： 醚基和二羥基等鍵合相 用于反相或正相色譜 極性鍵合相： 常用氨基氰基鍵合相（氰乙硅烷基Si(CH2)2CN)鍵合硅膠 一般用于正相色譜 特殊用途的鍵合相,115,（二）鍵合相的性質(zhì)和特點,鍵合反應 硅氧烷（SiOSiC）型：氯硅烷與硅膠進行硅烷化反應,如：YWGC18H37，無定形硅膠YWG上鍵合了 十八硅烷基；Spherisorb ODS，球形硅膠 Spherisorb 上鍵合了ODS。,116,鍵合相的性質(zhì)和特點,鍵合相的性質(zhì) 含碳量：含碳的百分數(shù) 覆蓋度 ：已反應的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例 封尾（end-capping）：在鍵合反

37、應后，用三甲基氯硅烷等進行鈍化處理，減少殘余硅醇基。,117,鍵合相的特點 使用過程中不流失； 化學穩(wěn)定性好； 適于梯度洗脫； 載樣量大 注意： 流動相的pH一般應在3-8，否則會引起硅膠溶解；(也有適用寬pH范圍的鍵合相)。,鍵合相的性質(zhì)和特點,118,二、化學鍵合相色譜法的流動相,對流動相的要求： 與固定相不發(fā)生化學反應。 對試樣有適宜的溶解度。使k在110范圍內(nèi)， 與檢測器相適應。例如用紫外檢測器時，選用截止波長小于檢測波長的溶劑。 純度高，粘度小。低粘度流動相如甲醇乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。,119,（一）流動相對分離的影響 n由色譜柱（固定相）性能決定， 主要受溶劑種類的影響，

38、k受溶劑配比的影響。,120,（二）流動相的強度和選擇性 溶劑的極性（強度） 正相色譜：溶劑極性越強，洗脫能力越強 反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強 溶劑的選擇性 不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同 混合溶劑（二元或多元流動相）,121,三、分離條件的選擇,（一）HPLC中的速率理論 渦流擴散A=2dp 球形、小粒度、均勻（RSD5%）固定相，勻漿高壓填充，以降低A。 縱向擴散=2Dm 可以忽略。 因為Dl很小，室溫操作，且U大于U最佳，,122,HPLC中的速率理論,傳質(zhì)阻抗 固定相傳質(zhì)阻抗CS可以忽略 ，因df極小 流動相傳質(zhì)阻抗Cm 要求： dp小，Dm大,123,靜態(tài)流動

39、相傳質(zhì)阻抗： 由于部分流動相在固定相微孔內(nèi)的滯留 靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗系數(shù)Csm Csm dp2， Csm 1/Dm，而DmT/ 要求: 固定相dp2、 流動相都小,HPLC中的速率理論,124,H=A+Cmu+Csmu 原因：化學鍵合相，液體流動相 結(jié)果：HPLC的實驗條件應該是：小粒度、均勻的球形化學鍵合相；低粘度流動相，流速不宜過快；柱溫適當。,HPLC中的速率理論,125,（二）正相鍵合相色譜法的分離條件,固定相 極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相等 流動相 烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑,126,（三）反相鍵合相色譜法的分離條件,固定相非極性鍵合相如ODS 流動相以水為基礎溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調(diào)節(jié)劑 弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制劑 加入0.1%1%的醋酸鹽、磷酸鹽可減少殘余硅醇基的作用,127,（四）反相離子對色譜法的分離條件,固定相 盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強的非極性鍵合相， 離子對試劑 離子對試劑所帶的電荷應與試樣離子的電荷相反 流動相pH使試樣組分與離子對試劑全部離子化 有機溶劑及其濃度 同一般HPLC,128,第三節(jié)高效液相色譜儀,組成 輸液系統(tǒng) 進樣系統(tǒng) 色譜柱系統(tǒng) 檢測系統(tǒng) 數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng),129,一、輸液系統(tǒng),高壓輸