1、分子診斷室項(xiàng)目介紹,內(nèi) 容,1.HBV-DNA熒光定量PCR 2.流式基本應(yīng)用 3.染色體核型分析,HBV DNA熒光定量PCR,4,PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,1985年美國(guó)PE-cetus公司的人類遺傳研究室mullis等人發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的PCR技術(shù)，從而使人們夢(mèng)寐以求的體外擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實(shí)。 1988年P(guān)E-cetus公司推出了第一臺(tái)PCR熱循環(huán)儀，從而使PCR技術(shù)的自動(dòng)化成為現(xiàn)實(shí)。 Mullis出因其卓越的貢獻(xiàn)與寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變的發(fā)明者M(jìn)ichael分享了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 隨著PCR技術(shù)的日臻成熟1995年出現(xiàn)熒光基因探針雜交定量PCR方法,5,PCR基本原理,類似DN

2、A的體內(nèi)復(fù)制，以單鏈DNA為模板，利用DNA聚合酶依賴于模板的特性，在附加的一對(duì)寡核苷酸引物之間催化合成互補(bǔ)鏈的過(guò)程。,6,DNA 合成的必備要素,DNA Polymerase dNTPs single-stranded template primer,7,定量PCR概念,以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過(guò)程的監(jiān)測(cè)，對(duì)PCR起始模板量的定量,8,常規(guī)PCR與定量PCR的比較,9,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理,指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。 Ct（cycle threshold)值定義：每個(gè)反應(yīng)管的熒

3、光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 熒光閾值（threshold)的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即： threshold=10SD cycle0-15,10,Ct值與起始模板的關(guān)系,每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,11,熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線,未知標(biāo)本,Crossing Point (Cycles),log (copy number),n,log (F2/F1),n,log (F2/F1),Targ

4、et,38,12,熒光檢測(cè)模式,（1）SYBR Green I 染料 （2）水解探針（Taqman） （3）雜交探針（Hybridization Probes） （4）分子信標(biāo)（molecular beacon) 發(fā)夾引物（sunrise primer) 蝎狀引物（scorpion primer) 復(fù)合探針（complex probes),13,探針的5端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，3標(biāo)記另一個(gè)熒光基團(tuán)。5端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3端熒光淬滅基團(tuán)（FRET），正常情況下檢測(cè)不到該探針5端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)。,Taqman探針原理,14,當(dāng)溶液中模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板

5、結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，Taq酶沿模板向前合成子鏈，當(dāng)延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換；,Taqman探針原理,15,Taqman探針原理,Taq酶的53外切酶活性將探針5端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái)，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，發(fā)出熒光，熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量。,16,定量PCR在乙肝檢測(cè)中意義,1. 判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性 2. PCR結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果的綜合評(píng)價(jià) 3. 觀察抗病毒藥物療效，指導(dǎo)藥物用量 4. 獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷 5. 預(yù)測(cè)病情、判斷預(yù)后 6. 器官移植、母嬰垂直

6、傳播,17,18,標(biāo)本留取及檢測(cè)步驟,標(biāo)本：靜脈血3ml，黃色蓋試管。標(biāo)本避免溶血和脂血。 檢測(cè)步驟：1.反應(yīng)液配制 2.核酸提取 3.核酸擴(kuò)增 結(jié)果分析：采用樣點(diǎn)擬合法，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到病毒的拷貝或IU/ML。,19,1.分區(qū)操作：PCR具有超敏感性，因此在檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)分區(qū)操作，即分為試劑準(zhǔn)備區(qū)，樣品處理區(qū)，PCR擴(kuò)增區(qū)。 2.試驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用紫外消毒至少30分鐘。 3.操作時(shí)戴一次性手套，加樣頭要求及時(shí)更換，吸液時(shí)避免飛濺。,注意事項(xiàng),20,4.每天實(shí)驗(yàn)前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸鈉液，實(shí)驗(yàn)時(shí)將吸頭、離心管丟入廢液缸中浸泡。 5.所有試劑試驗(yàn)前充分融化，避免反復(fù)凍融

7、。 6.每次PCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照。,注意事項(xiàng),流式基本應(yīng)用,22,流式細(xì)胞術(shù)的概念,流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡(jiǎn)稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且能夠同時(shí)檢測(cè)快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性，并加以定量的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選 研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征,23,流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍,細(xì)胞結(jié)構(gòu) 細(xì)胞大小 細(xì)胞顆粒度 細(xì)胞表面面積 核漿比例 DNA含量與細(xì)胞周期 RNA含量 蛋白質(zhì)含量,細(xì)胞功能 細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原 細(xì)胞活性 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 酶活性 激素結(jié)

8、合位點(diǎn) 細(xì)胞受體,24,散射光信號(hào),Right Angle Light Detector Cell Complexity SSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter） 細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對(duì)復(fù)雜性,25,外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）,26,熒光信號(hào),使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析 熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量,27,數(shù)據(jù)分

9、析,數(shù)據(jù)顯示: 直方圖 ( Histogram ) 二維點(diǎn)圖(Dot Plot) 等高線圖(Contour Plot) 密度圖 (Density) 三維圖（3D Plot）,28,流式的臨床應(yīng)用,淋巴細(xì)胞亞群分析 白血病和淋巴瘤的免疫分型 腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析 網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè) 干細(xì)胞計(jì)數(shù) 陣發(fā)性血紅蛋白尿 HLA-B27檢查 血小板功能及相關(guān)疾病 HIV免疫分型，CD4絕對(duì)計(jì)數(shù),29,淋巴細(xì)胞亞群分析,使用經(jīng)熒光素標(biāo)記的特異單克隆抗體，進(jìn)行多色染色，同時(shí)分析淋巴細(xì)胞膜上多種白細(xì)胞分化抗原（CD分子）的表達(dá)，可以將淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開(kāi)，進(jìn)行定性分析 各淋巴細(xì)胞亞群的百分

10、含量 淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)，進(jìn)行定量分析,30,根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為 B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫有關(guān) T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān) 總T和總B可以用來(lái)判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能，能夠介導(dǎo)對(duì)某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。,31,根據(jù)CD4、CD8表達(dá)，T淋巴細(xì)胞又分為 T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+），即 Th/Ti T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+）,即 Ts/Tc Th/Ts比值 可用于評(píng)價(jià)自身免疫失調(diào)、被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài),32,臨床意義,診斷原發(fā)性

11、免疫缺陷?。ㄈ缦忍煨詿o(wú) r 球蛋白血癥）或繼發(fā)性免疫缺陷?。ㄈ鏏IDS） 造血干細(xì)胞移植后免疫重建（6個(gè)月NK；9個(gè)月T、B） Th/Ts：機(jī)體免疫功能亢進(jìn)：自身免疫性疾病，如SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等（治療有效恢復(fù)正常） Th/Ts：機(jī)體免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活動(dòng)性肝炎和活動(dòng)性肝硬化、再障、結(jié)核、腫瘤等,33,臨床意義,移植后動(dòng)態(tài)免疫監(jiān)測(cè)： 急排臨床癥狀出現(xiàn)前1-5天，活化T和Th/Ts持續(xù)，1.2預(yù)示急排； Th/Ts持續(xù)表明可能感染，比值1.08，可能性大，0.2應(yīng)停用免疫抑制劑； 實(shí)體腫瘤療效和病人免疫狀態(tài)觀察 治療前常伴T 、Th/Ts，放/化療有效可恢復(fù)； 淋巴細(xì)胞免

12、疫表型正?；蛑委熀竽芑謴?fù)正常者預(yù)后常較好； 探索疾病發(fā)病機(jī)理、進(jìn)程和預(yù)后（炎癥、腫瘤）,34,淋巴細(xì)胞亞群雙色分析,35,先天性無(wú) r 球蛋白血癥,36,淋巴細(xì)胞亞群雙色分析,37,HLA-B27, HLA-B27是MHC I類抗原，在有核細(xì)胞上廣泛表達(dá) HLA-B27的表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎高度相關(guān)，超過(guò)90%的強(qiáng)直性脊柱炎患者HLA-B27陽(yáng)性。 其他，如Reiter s綜和癥陽(yáng)性率70-90%，銀屑病性關(guān)節(jié)炎陽(yáng)性率50-60%，葡萄膜炎陽(yáng)性率40-50% 檢測(cè)采用全血，無(wú)需分離淋巴細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地分析HLA-B27。 結(jié)果報(bào)告檢測(cè)的平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)界值判定，得到陰性/

13、陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)的靈敏度為100%，特異性為97.5%。,38,流式細(xì)胞儀的應(yīng)用（血液）,白血病和淋巴瘤免疫分型 造血干細(xì)胞計(jì)數(shù) 陣發(fā)性血紅蛋白尿（PNH）診斷 網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù) 血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表達(dá) 血小板活化 網(wǎng)織血小板分析,39,流式細(xì)胞儀的應(yīng)用（腫瘤）,細(xì)胞周期和倍體分析 腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究 抗腫瘤藥物作用機(jī)制的研究 放療/化療療效的研究 多藥耐藥基因的研究 細(xì)胞凋亡的分析 凋亡細(xì)胞的分析 凋亡相關(guān)蛋白的分析,40,流式標(biāo)本留取,紫色蓋試管，EDTA抗凝血或骨髓1-2ml。 不能有凝塊。 單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)不少于106個(gè)。,41,染色體核型分析,42,基本概念,染色體核型

14、：指一個(gè)物種所特有的染色體數(shù)目和每一條染色體的形態(tài)特征。-人類體細(xì)胞中共有23對(duì)染色體，22對(duì)常染色體，一對(duì)性染色體。 核型分析：將待測(cè)細(xì)胞的核型進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)特征分析的過(guò)程稱核型分析。如正常女性核型：46,XX 正常男性核型：46，XY。 核型模式圖：是指將一個(gè)染色體組的全部染色體逐個(gè)按其特征繪制下來(lái)，再按長(zhǎng)短、形態(tài)等特征排列起來(lái)的圖像。,43,染色體模式圖,44,人類23對(duì)染色體,45,46,染色體編號(hào)(人X染色體),記述一特定帶時(shí)，需要寫明4個(gè)內(nèi)容：染色體號(hào)，長(zhǎng)短臂，區(qū)的號(hào)序和帶的號(hào)序。這些內(nèi)容按順序?qū)?，不用間隔或加標(biāo)點(diǎn)。如果某一帶被再細(xì)分，在原帶號(hào)數(shù)后加一小數(shù)點(diǎn)，編號(hào)原則仍按從著

15、絲粒往臂端序貫編號(hào)。如1p31.2代表一號(hào)染色體短臂3區(qū)1帶第2亞帶,47,染色體標(biāo)本常規(guī)制備,方法 ：中期染色體G帶顯色 原理 ：采用秋水仙素處理培養(yǎng)的細(xì)胞，使細(xì)胞停留在分裂中期，再用低滲液處理細(xì)胞，使細(xì)胞脹大，以進(jìn)行染色體制片。G-帶是標(biāo)本片經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，用Giemsa染色顯示的帶紋。,48,操作步驟,細(xì)胞培養(yǎng)： 細(xì)胞培養(yǎng)液5mL（含植物凝血素），加 0.3mL肝素抗凝全血37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)6872小時(shí)。 收獲細(xì)胞： 終止培養(yǎng)前11.5小時(shí)加入秋水仙素。 制片：低滲-預(yù)固定-固定-滴片-干燥老化 G-顯帶，圖像分析：胰酶消化， Giemsa染色，采集圖像，分析20-30個(gè)中期分裂相,49,

16、核型描述,首先列出染色體總數(shù)，然后是性染色體組成，接著列出異常的染色體數(shù)目或形態(tài)。下列統(tǒng)一的命名符號(hào)： A-G 染色體組的名稱 1-22 染色體編號(hào) X,Y 性染色體 del 缺失 der 結(jié)構(gòu)重排的染色體 dup 重復(fù) inv 倒位 t 易位 +/- 在染色體符號(hào)前表示染色體增加或減少，在染色體符號(hào)后表示染色體多出或缺少一部分,50,檢查適應(yīng)癥及意義,生殖功能障礙 在不孕癥、多發(fā)性流產(chǎn)和畸胎等有生殖功能障礙的婦夫中至少有7%10%是染色體異常的攜帶者。常見(jiàn)的有染色體結(jié)構(gòu)異常如平衡易位和倒位以及數(shù)量異常如由于女性少一條X染色體造成的45，XO，或多一條Y染色體造成的47，XXY。平衡易位和倒位

17、由于無(wú)基因的丟失，攜帶者本身常并不發(fā)病，卻可因其生殖細(xì)胞染色體異常而導(dǎo)致不孕癥、流產(chǎn)和畸胎等生殖功能障礙。性染色體數(shù)目異常除可造成不孕外，還常出現(xiàn)第二性征異常。,51,檢查適應(yīng)癥及意義,第二性征異常者 如有原發(fā)性閉經(jīng)、性發(fā)育不良，伴身材矮小、肘外翻、盾狀胸和智力稍有低下,陰毛、腋毛少或缺如，后發(fā)際低，不育等，應(yīng)考慮是否有X染色體異常。常見(jiàn)的X染色體異常有特納氏綜合征和環(huán)形X染色體。特納氏綜合征患者比正常女性少一條X染色體，其染色體核型為：45，X0。環(huán)形X染色體患者由于某種原因使X染色體兩端同時(shí)出現(xiàn)斷裂，并在斷裂部位重接形成，環(huán)形染色體越小臨床癥狀越重。早期發(fā)現(xiàn)這些異常并給予適當(dāng)?shù)闹委熆墒沟诙哉鞯玫揭欢ǔ潭鹊馗纳?，也可能獲得生育能力。,52,檢查適應(yīng)癥及意義,外生殖器兩性畸形 根據(jù)生