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文檔簡介

1、TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）法實際上是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。,TdT介導的dUTP缺口末端標記技術(TUNEL),TUNEL,TUNEL的原理,TUNEL的操作步驟,結果及注意事項,主要試劑,1. 緩沖液(Labeling Buffer)：

2、用于維持一定的反應條件，含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸鉀、 pH7.2 10mmol/L CoCl2 (氯化鈷)、1mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)。 2.末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT) ： 催化3-OH末端 dUTP反應的關鍵酶 3.熒光素-dUTP ： TdT的底物和本實驗的標記物 4.蛋白酶K： 消化組織，增加細胞通透性,凋亡細胞的特征是:內源性核酸內切酶被激活，細胞自身的染色質DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點數(shù)目相同的 3-OH末端 。末端脫氧核糖核酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)能將脫氧核

3、糖核苷酸連接到DNA的3-末端。 TUNEL的原理是：用熒光素（fluorescein）標記的脫氧核糖核苷酸，在TdT 的作用下連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3-OH末端，用熒光顯微鏡即可觀察結果。在此基礎上連接辣根過氧化酶標記的熒光素抗體，可進一步放大檢測信號，并且普通顯微鏡觀察實驗結果。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。,TUNEL原理,標本處理,實驗步驟,實驗流程,結果,注意事項,極少數(shù)細胞凋亡時沒有DNA斷裂或DNA裂解不完全，此時不適用TUNEL法檢測，進而產(chǎn)生假陰性結果。 在個別類型的壞死細胞中也發(fā)現(xiàn)TUNEL檢測呈陽性。在高度增殖/代謝的組織細胞中可產(chǎn)生

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