1、實(shí)驗(yàn)2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)儀器，材料及試劑實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)結(jié)果和討論，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，了解瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠制作及傳記游泳方法，實(shí)驗(yàn)原理，凝膠電泳分離及純化DNA片段最常用的技術(shù)。根據(jù)準(zhǔn)備凝膠的材料，分為瓊脂糖傳記神童和聚丙烯酰胺傳記神童。瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖)是基因工程工作中常見的實(shí)驗(yàn)方法，可以檢測(cè)少量的DNA(例如，用肉眼觀察就能檢測(cè)到10 ng的DNA)，檢查范圍很廣。瓊脂糖天然聚合長(zhǎng)鏈分子，溶解在沸水中，開始形成45個(gè)多孔剛性過濾孔，凝膠孔徑由大小瓊脂糖濃度決定。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，加上電場(chǎng)作用，向兩極游泳。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量

2、的對(duì)數(shù)成反比。瓊脂糖是線性多糖聚合物。濃度越高，洞越小，辨別力越強(qiáng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中游泳時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。如果不同的DNA、分子量大小及配置不同，傳記的泳動(dòng)率不同，可以區(qū)分不同的樂隊(duì)。用瓊脂糖凝膠電泳方法分離DNA是利用分子篩效應(yīng)，移動(dòng)速度與分子量對(duì)數(shù)值成反比，可以根據(jù)DNA分子的大小分離。牙齒過程可以將分子量標(biāo)準(zhǔn)參考物與樣品一起傳記電泳檢查。溴化乙在紫外線照射下能釋放熒光。當(dāng)DNA樣本從瓊脂糖凝膠游向陰極時(shí)，溴化乙從陽極移動(dòng)到陰極，溴化乙由分子嵌入DNA分子形成復(fù)合物，使DNA在紫外線下釋放出強(qiáng)烈的熒光。如果溴化B足夠，熒光的強(qiáng)度可以與DNA的含量成正比檢測(cè)DNA的濃度。注意

3、事項(xiàng)：EB是致癌物質(zhì)，不要用手接觸，不要污染環(huán)境。在實(shí)驗(yàn)過程中，操作要安靜沉著，注意不要污染樣品。實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑，(1)儀器1。水平凝膠電泳插槽2。鎮(zhèn)流器傳記靈動(dòng)機(jī)3。用電4。紫外線探測(cè)器5。桌上型離心機(jī)，(2)材料實(shí)驗(yàn)1的PCR產(chǎn)品，(c)試劑1。每個(gè)陣地2。TAE傳記電泳緩沖(50) (pH8.0) Tris 242g冰醋酸57.1ml 0.5mol/l EDTA(ph 8.0)100ml 3。溴化b溶液10mg/4。10DNA樣本父緩沖液，溴化B (EB)嵌入熒光染料，EB分子嵌入核酸對(duì)鏈的堿基對(duì)之間，通過紫外線釋放紅色熒光。熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。因此，可以粗略估計(jì)樣本DNA

4、濃度。瓊脂糖凝膠EB染色可用肉眼看到核酸傳記永凍帶，其DNA量通常為5ng。核酸染色劑，注意事項(xiàng)：EB是致癌物質(zhì)，不要用手接觸，不要污染環(huán)境。傳記電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中形成紫色，一般為蔗糖、甘油或聚蔗糖400等緩沖液。作用：增加樣本比重，使DNA均勻沉淀在附加孔中。形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測(cè)核酸傳記神童的速度和位置。給樣品上色，使樣品添加工作更加方便。胃緩沖液，實(shí)驗(yàn)階段：每陣地凝膠準(zhǔn)備，1 .將傳記游泳罐、制膠槽、梳子、擋板洗凈晾干。2.擋板，請(qǐng)插上梳子。3.根據(jù)實(shí)驗(yàn)，取0.4克瓊脂糖，放入明膠容器(通常使用三角瓶)，然后放入40毫升傳記電泳緩沖液(1TAE)。4.請(qǐng)加熱煮沸，使瓊脂糖完

5、全融化。5.溶液冷到約60時(shí)，放入溴化乙基4 L(最終濃度為0.5 g/ml)，輕輕搖動(dòng)，看橡膠桶中是否有泡沫。6 .在室溫下，大約30-45分鐘后，瓊脂糖溶液完全凝固，垂直拉梳子和擋板，去除碎膠，將凝膠放入傳記游泳罐中。7.將傳記電泳緩沖液(1TAE)添加到傳記電泳槽中，使液體水平比膠棉高約1mm。8.在DNA樣本中加入2 L (1/10體積)的10 DNA父緩沖液，攪拌，稍微搖晃，將溶液放在離心管底部。9.用移動(dòng)器吸出離心管內(nèi)的溶液，然后轉(zhuǎn)移到凝膠的雨水孔。，10 .插入電線，打開傳記靈動(dòng)器的電源，必要時(shí)將電壓調(diào)節(jié)到120V，傳記靈動(dòng)開始，觀察電流情況或傳記游泳插槽陰極上的鉑絲上是否出現(xiàn)氣

6、泡。(威廉莎士比亞、傳記、傳記、傳記、傳記、傳記、傳記、傳記、電力)11。溴酚藍(lán)游泳移動(dòng)到凝膠前面，然后將電壓(或電流)返回到0，關(guān)閉電源，停止傳記解凍。12.除去凝膠，在紫外線觀測(cè)器中觀察傳記電泳結(jié)果。13.根據(jù)需要切割DNA帶，放入1.5ml Ep管，保存4次，準(zhǔn)備下一次實(shí)驗(yàn)。使用PCR產(chǎn)品的瓊脂糖凝膠電泳，3 mg DNA Marker DL2，000(500 ng/條帶)，1%瓊脂糖凝膠電泳，每個(gè)DNA帶從上到下各2kb，1Kb，250bp，100bp，瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法的幾個(gè))添加樣品時(shí)，槍不要損壞凝膠墻。否則DNA的樂隊(duì)就不整齊了。添加樣品前，用槍吸凝膠孔的溶液，去除樣

7、品空中的泡沫。2)每個(gè)孔的最大DNA樣本量取決于DNA樣本片段的大小、數(shù)量、樣本孔形狀和容量。3.)要注意每個(gè)樣品的最大上樣品容量和樣品孔體積。添加時(shí)，應(yīng)確保樣品流入附近樣品孔，產(chǎn)生交叉污染，不影響結(jié)果分析。另外，每個(gè)陣地的凝膠電泳中的其他注意事項(xiàng)包括：1.)在凝膠中加入EB進(jìn)行傳記電泳，可以很容易地在紫外線下觀察傳記游泳狀態(tài)，但EB可能會(huì)降低線性DNA遷移率。)在傳記游泳過程中，溴化乙向陰極移動(dòng)，與DNA游泳的方向相反，長(zhǎng)傳記電泳在正向凝膠中溴化乙的含量低，很難檢測(cè)含量低的小分子DNA片段。處理方法是將凝膠在0.5ug/ml的EB溶液中染色3045分鐘。)判斷陽極的另一種方法是，陰極氣泡(H

8、2)比陽極氣泡(O2)多一倍。問題1。影響傳記電泳遷移率的因素是什么？解釋瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理。復(fù)習(xí)思維測(cè)試問題，用多功能DNA純化回收試劑盒(離心柱型)回收DNA，如果存在高濃度鹽離子，DNA片段有選擇地吸附在離心柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜上，并通過一系列快速?zèng)_洗離心步驟去除蛋白質(zhì)液和沖洗液，將去除引物、核苷酸、蛋白酶等雜質(zhì)，最后成為低鹽、高PP。1在長(zhǎng)波紫外線燈下，用干凈的刀片剪下需要回收的DNA帶，盡量剪下沒有DNA的凝膠，凝膠體積越小越好。(David aser，Northern Exposure，美國(guó)電視電視劇)，Northern Exposure 2 DNA波段凝膠切開，放入1.5m

9、l離心管，稱重。先裝上空的1.5毫升離心管重量，加入凝膠，然后再減去重量，得到凝膠的重量。添加3倍體積溶膠/結(jié)合液DB。如果凝膠的重量為0.1g，體積可視為100l，則添加300l溶液。456水浴放5分鐘(或直到膠水完全融化)。旋渦振動(dòng)有助于加速溶解每2-3分鐘。將5前階段的溶液放入吸附柱AC(將吸附柱放入收集管)，12,000 rpm離心力30-60秒，將收集管的廢液倒進(jìn)去。如果總體積超過750l，可以將溶液添加到同一吸附柱AC兩次。6加入700l沖洗液WB(請(qǐng)先確認(rèn)是否添加了無水乙醇！)，12，000 rpm離心1分鐘，廢液報(bào)廢。7添加500l沖洗液WB 12，000 rpm離心1分鐘，廢棄廢液。8將吸附柱AC放回共收管，沖洗12,000 rpm離心2分鐘，去除沖洗液