1、PCR-SSP檢測HLA-B27,一、實驗目的 掌握HLA基因分型的原理，學習PCR-SSP基因分型方法。 二、實驗原理 編碼HLA的基因具有高度的多態(tài)性，每一個基因座位上有眾多的復等位基因，而每一個等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相應的序列特異性引物（ sequence specific primers ，SSP）進行擴增。通過控制PCR反應條件，特異性引物僅擴增與其相應的等位基因，而不擴增其他的等位基因。,實驗步驟,PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳,抽提DNA,PCR擴增的基本原理,模板DNA的變性（熱變性） 模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離 模板DNA與引 物的退火(復

2、性)： 模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合； 引物的延伸： DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈 重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。,PCR擴增體系,模版DNA 上游引物 下游引物 dNTP（原料） 緩沖體系(各種離子與水) 耐熱的DNA聚合酶,Polymorphism in the MHC Variation 1% at a single genetic locus in a

3、 population of individuals Each polymorphic variant is called an allele In the human population, over 1,200 MHC alleles have been identified. MHC genes are the most polymorphic known,Polymorphic residues are located in the antigen-binding groove Variation in amino acid sequences changes the shape of

4、 the groove,Schematic diagram of class I and class II MHC genes, mRNA transcripts, and protein molecules,Every HLA allele has its own unique sequences,Specific sequence primer (SSP) is designed to bind to the allelic sequences complementarily,Sequence specific primer is used to type HLA allele with

5、PCR,Sequence specific primer is used to type HLA allele with PCR,三、實驗材料和方法 1、血樣：0.2 ml EDTA 抗凝血 2、紅細胞裂解液 3、白細胞裂解液 4、PCR 混合液 PCR buffer HLA-B27 SSP Taq dNTP internal positive reference primers,HLA-B27檢測操作流程,一、DNA的提取 1、取1ml RBC裂解液入血樣管中混勻，裂解RBC; 2、離心4000rpm2min; 3、重復步驟1-2兩次，最后用棉簽吸干管壁液體； 4、取100ulWBC裂解液入

6、上述WBC管中混勻； 5、將WBC管于60oC水浴消化20min； 6、取出WBC管再于100oC，3-5min，滅活蛋白酶K； 7、離心10000rpm2min。上清即為富含DNA的PCR模板。,二、PCR擴增 1、吸2ul模板DNA入裝有PCR混合液的小管中（注意不要加到石蠟油層）； 2、將小管置于PCR儀內進行擴增。（需80min）, 12, 23,預變性： 94 oC 2min 變性：94 oC 12sec 復性：62 1min 延伸：72 30sec 變性：94 oC 12sec 復性：58 oC 50sec 延伸：72 oC 30sec 37 oC 10sec,HLA-B27擴增程序,三、電泳檢測 吸PCR產物10ul加到2%瓊脂糖凝膠孔內； 將瓊脂糖凝膠板置電泳槽內電泳160V20min后取出，觀察結果。,四、結果觀察,Spe