1、藥品微生物限度與無菌檢查方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的要點(diǎn)及體會(huì),中國藥品生物制品檢定所 馬仕洪 北京 2007年1月,web site: e-mail: tel地址：北京市天壇西里2號(hào) 郵編：100050,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,2,一、方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的背景及程序,1、關(guān)于方法驗(yàn)證（背景） 2、方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的一般原則和程序,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,3,1、關(guān)于方法驗(yàn)證（背景）,中國藥典2005版 國食監(jiān)注2005234號(hào)“關(guān)于頒布和執(zhí)行中國藥典2005年版有關(guān)事宜的通知” 國藥典發(fā)200598號(hào)“關(guān)于執(zhí)行中國藥典2005年版微生物限度檢查法和無菌

2、檢查法有關(guān)問題的說明” 中檢藥2006862號(hào)“第七屆全國藥品檢驗(yàn)所抗生素室主任工作會(huì)議暨全國藥品微生物檢驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)研討會(huì)會(huì)議紀(jì)要”,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,4,為什么驗(yàn)證?,1）、采用經(jīng)過驗(yàn)證的方法，是分析測(cè)量科學(xué)的基本要求，是各種法規(guī)遵循工作的基礎(chǔ)。藥品微生物檢查作為整個(gè)藥品質(zhì)量體系中的一個(gè)環(huán)節(jié)，應(yīng)與其他檢驗(yàn)項(xiàng)目一樣，對(duì)方法和條件進(jìn)行考察，以保證結(jié)果的科學(xué)性，如鑒別、含量測(cè)定。 2）、驗(yàn)證的思想其實(shí)早已貫徹于微生物檢測(cè)的諸多方面：無菌環(huán)境驗(yàn)證（塵埃離子、浮游菌、沉降菌檢測(cè)）、滅菌器的驗(yàn)證、培養(yǎng)基靈敏度檢測(cè)、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照等等。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定

3、所,5,為什么驗(yàn)證?,3）、2005版充分借鑒發(fā)達(dá)國家經(jīng)驗(yàn)，將微生物檢查方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了更加系統(tǒng)化的規(guī)定和要求。驗(yàn)證實(shí)際上伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗(yàn)證），保證其對(duì)結(jié)果判斷沒有影響。 4）、有了系統(tǒng)的方法驗(yàn)證，可以避免以往因?yàn)殛栃跃x擇不合理、方法不合理而造成的漏檢、誤判，以保證結(jié)果的科學(xué)可靠，這一點(diǎn)無論對(duì)于當(dāng)前無菌檢查的一次性報(bào)告，還是對(duì)于實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證認(rèn)可、以及新的藥品注冊(cè)管理辦法的要求都是相一致的。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,6,為什么驗(yàn)證？,5）、驗(yàn)證的必要性（質(zhì)量控制的新手段）：,不同企業(yè)以及同企業(yè)不同批次黃連上清丸稀釋法的回收率比較

4、試驗(yàn)結(jié)果，可能反映了不同黃連上清丸樣品的質(zhì)量差異。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,7,表5 七企業(yè)黃連上清丸稀釋法的回收率比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Tab 1 Recovery of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from 7 corporations,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,8,表6 同廠不同批黃連上清丸稀釋法的回收率比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1：200）Tab 2 recoverice of dilute method in microbiological test of huanglia

5、nshangqingwan from different batchs in same corporation (1:200),2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,9,2、方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的一般原則和程序,驗(yàn)證什么？ 怎么驗(yàn)證？,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,10,驗(yàn)證什么？,微生物檢驗(yàn)： 某種樣品采用某種方法得到一個(gè)檢查結(jié)果。,What？,供試品影響,方法的有效性,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,11,驗(yàn)證什么？,需前處理,不需前處理,有抑菌作用,無抑菌作用,樣品,檢查,去除抑菌作用,驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長、檢出的影響。,驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對(duì)污

6、染菌生長、檢出的影響。,可以通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)判斷,圖1 藥品微生物檢查方法驗(yàn)證的一般程序與環(huán)節(jié),What？,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,12,驗(yàn)證什么？需要驗(yàn)證的重點(diǎn)環(huán)節(jié),驗(yàn)證實(shí)際上伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗(yàn)證），保證其對(duì)結(jié)果判斷沒有影響。 前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應(yīng)在驗(yàn)證范圍內(nèi)。已有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程（SOP）和充足實(shí)驗(yàn)證明的前處理方法可以直接采用，但出現(xiàn)疑問應(yīng)進(jìn)一步研究提高。 供試品中抗菌活性的去除是當(dāng)前驗(yàn)證工作的重點(diǎn)。尤其強(qiáng)調(diào)應(yīng)充分驗(yàn)證供試品本身對(duì)微生物生長的影響。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,13,方法疑問實(shí)例菌在何處

7、？,表7 10ml菌懸液500r/min離心5min離心后離心管不同部位菌懸液的計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/mL）,離心集菌法：500r/min離心5min r/min = g？,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,14,怎么驗(yàn)證？,利用供試品與微生物的差異，降低或消除供試品的影響，通過模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)降低或消除效果加以檢驗(yàn)。,How?,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,15,稀釋法 薄膜法 中和法 離心法,供試品,前處理,去除抗菌活性,稀釋 溶解 分散 萃取 離心,供試品污染微生物檢查,驗(yàn)證,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,16,供試品中抗菌活性的去除,稀釋法降低供試品的相對(duì)濃度 薄

8、膜法利用體積差異分離 中和法利用化學(xué)（生物）專屬性滅活 離心法利用沉降系數(shù)差異分離,各方法組合運(yùn)用，效果更佳！,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,17,抗菌活性去除效果的檢驗(yàn),應(yīng)根據(jù)供試品的特點(diǎn)，選擇敏感菌株，對(duì)供試品抗菌活性去除效果加以檢驗(yàn)（陽性菌的回收實(shí)驗(yàn)），再按藥典要求全面驗(yàn)證，提高效率。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,18,選擇敏感菌株,間接方法文獻(xiàn)、技術(shù)資料（可靠） 直接方法預(yù)實(shí)驗(yàn)（體外抑菌實(shí)驗(yàn)） 參考選擇： 一般中藥選擇枯草和金葡； 一般抗生素根據(jù)抗菌譜選擇。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,19,表8 選擇敏感菌株,2020/8/2,中國藥品生物制品

9、檢定所,20,二、方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的幾個(gè)要點(diǎn),1、無菌檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn) 2、微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn) 3、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,21,1、無菌檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn),樣品 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 標(biāo)準(zhǔn)化操作 實(shí)驗(yàn)器材,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,22,無菌檢查樣品,無菌檢查樣品,取樣量 （量）,樣品特性 （質(zhì)）,抗菌活性,劑型,檢驗(yàn)數(shù)量,檢驗(yàn)量,側(cè)重驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),側(cè)重?zé)o菌檢查,敏感菌選擇 去除抗菌活 性方法選擇,前處理方法,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,23,無菌檢查樣品,主要是取樣量的問題 中國藥典2005年版對(duì)無菌檢查的“檢驗(yàn)數(shù)量”和“檢驗(yàn)量

10、”作了明確的解釋和規(guī)定。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,24,表2中上市抽驗(yàn)樣品（液體制劑）的最少檢驗(yàn)量,* 每種培養(yǎng)基各接種10支供試品,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,25,表3中上市抽驗(yàn)樣品（固體制劑）的最少檢驗(yàn)量,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,26,表3注釋,*1 ：每種培養(yǎng)基各接種10支供試品。 *2 ：抗生素粉針劑(5g)及抗生素原料藥(5g)的最少檢驗(yàn)數(shù)量為6瓶(或支)，桶裝固體原料的檢驗(yàn)數(shù)量為4個(gè)包裝。 *3 ：如果醫(yī)用器械體積過大，培養(yǎng)基用量可在2000ml以上，將其完全浸沒。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,27,無菌檢查樣品,三

11、點(diǎn)體會(huì)： 一是附錄規(guī)定檢驗(yàn)量的表格中不包括陽性對(duì)照用樣品量，雖然附錄另處有專門說明，仍然容易忽略；,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,28,無菌檢查樣品,三點(diǎn)體會(huì)： 二是無菌檢查時(shí)應(yīng)強(qiáng)調(diào)“檢驗(yàn)數(shù)量”，主要是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的代表性，而陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)僅須滿足“檢驗(yàn)量”總量要求即可，以檢驗(yàn)樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，即保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可以由此減少大量的樣品；,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,29,無菌檢查樣品,三點(diǎn)體會(huì)： 三是對(duì)“檢驗(yàn)數(shù)量”和“檢驗(yàn)量”的把握應(yīng)考慮便于實(shí)際操作，比如處理100ml/袋的樣品，取9袋樣品一次分配到一組三聯(lián)濾器，“檢驗(yàn)數(shù)量”大于藥典規(guī)定的6

12、個(gè)，但“檢驗(yàn)量”似乎不符合藥典規(guī)定的每袋樣品取半量檢驗(yàn)的規(guī)定，僅為1/3，但根據(jù)藥典“檢驗(yàn)量”即為“一次實(shí)驗(yàn)所用供試品的總量（g或ml）”的解釋，這與先將6袋分配兩個(gè)濾筒、再將剩下3袋抽入一個(gè)濾筒作為陽性對(duì)照的方法一樣，卻更節(jié)省時(shí)間。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,30,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis CMCC（B）63 501 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC（B）26 003 生孢梭菌 Clostridium sporogenes CMCC（B）64 941 銅綠假單胞菌 Pseudomonas aerug

13、inosa CMCC（B）10 104 大腸埃希菌 Escherichia coli CMCC（B）44 102 白色念珠菌 Candida albicans CMCC（F）98 001 黑曲霉 Aspergillus niger CMCC（F）98 003,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,31,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,驗(yàn)證用菌種的保藏 使用頻繁 傳代限制（5代）,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,32,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,菌種保藏及應(yīng)用參考方法： 干菌種（0代） 100ml液體培養(yǎng)基復(fù)蘇（1代） 100ml液體培養(yǎng)基復(fù)壯（2代） 加100ml 20%無菌甘油混勻，1ml/管凍存管分

14、裝，-20或-80保存 每次使用取1支自然（室溫）解凍，取0.1ml接種至10ml液體培養(yǎng)基（生孢梭菌用12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基）按規(guī)定培養(yǎng)、稀釋（3代）,注意：已經(jīng)解凍的凍存管不能再冷凍保存，以免凍融！,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,33,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身操作習(xí)慣總結(jié)出一套切實(shí)可行、快速穩(wěn)定的菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程序。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,34,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,參考菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程序： 取經(jīng)34培養(yǎng)18-24小時(shí)的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠假單胞菌與大腸埃希菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1ml，加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，分別10倍稀釋備

15、用（枯草芽孢桿菌至10-5、金黃色葡萄球菌10-6、綠假單胞菌與大腸埃希菌至10-7）；,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,35,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,參考菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程序： 取經(jīng)34培養(yǎng)1824小時(shí)的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)物1ml，加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-7備用；,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,36,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,參考菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程序： 取經(jīng)24 培養(yǎng)1824小時(shí)的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)物1ml，加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5備用；,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,37,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,參考菌液制

16、備標(biāo)準(zhǔn)程序： 取經(jīng)培養(yǎng)一周的黑曲霉菌改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加0.9%無菌氯化鈉溶液5ml，洗下孢子，轉(zhuǎn)移至另一空管，加0.9%無菌氯化鈉溶液至與標(biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相當(dāng)后，取1ml加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-4備用。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,38,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,關(guān)于黑曲霉：,轉(zhuǎn)種操作應(yīng)在超凈工作臺(tái)（或相當(dāng)此環(huán)境）中進(jìn)行，關(guān)閉風(fēng)機(jī)，靠近酒精燈操作； 置2328培養(yǎng)57日，培養(yǎng)斜面形態(tài)可參照下圖； 轉(zhuǎn)種完畢的凍存管和使用過的器具應(yīng)經(jīng)121濕熱滅菌30分鐘再作處理；,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,39,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,關(guān)于黑曲霉：,黑曲霉孢

17、子相當(dāng)穩(wěn)定，可以保存于4 0.9%氯化鈉溶液中較長時(shí)間，作為孢子懸液儲(chǔ)備液使用。由此可以減少菌液制備工作量和反復(fù)操作黑曲霉的風(fēng)險(xiǎn)。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,40,菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液,菌液檢驗(yàn)： 結(jié)合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。 生孢梭菌可在同步硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基靈敏度實(shí)驗(yàn)中計(jì)數(shù)。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,41,標(biāo)準(zhǔn)化操作,方法選擇 樣品處理 沖洗方法和條件 中和劑加入 菌液加入,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,42,標(biāo)準(zhǔn)化操作,方法選擇 取樣量大于5ml/支直接接種法不再適用； 除非樣品不許可（難溶解），發(fā)展趨勢(shì)應(yīng)采用全封閉的薄膜過濾法。,2020/

18、8/2,中國藥品生物制品檢定所,43,標(biāo)準(zhǔn)化操作,樣品處理 主要強(qiáng)調(diào)固體樣品的溶解、轉(zhuǎn)移、均勻分配問題。通常將規(guī)定取樣量全部轉(zhuǎn)移到400500ml稀釋劑或者適宜溶液，再進(jìn)行分配。 各廠家均專門開發(fā)有固體制劑（粉針）專用濾器，我們提出了更為簡(jiǎn)便的無菌三針單聯(lián)管。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,44,標(biāo)準(zhǔn)化操作,沖洗方法 強(qiáng)調(diào)少量多次：50ml/次； 強(qiáng)調(diào)充分振搖； 操作細(xì)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，如集菌儀轉(zhuǎn)速、沖洗過程中蓋還是不蓋濾筒下口等等。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,45,標(biāo)準(zhǔn)化操作,菌液加入 菌液組、供試品加菌液組嚴(yán)格一致。 生孢梭菌的加入,2020/8/2,中國藥品生物制

19、品檢定所,46,標(biāo)準(zhǔn)化操作,中和劑加入 不同中和劑加入方式可能效果不一樣。通過我們的經(jīng)驗(yàn)，基本傾向于直接加入培養(yǎng)基中效果最好。但如果某些中和劑對(duì)微生物生長不利可考慮其他步驟加入。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,47,標(biāo)準(zhǔn)化操作,菌液加入 按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，主要是考慮濾器的有效性。 濾器的有效性應(yīng)由提供企業(yè)控制，用戶可采用適當(dāng)方法抽查（如檢查陽性菌液通過濾筒的流出液）。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,48,標(biāo)準(zhǔn)化操作,菌液加入 而驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質(zhì)對(duì)陽性菌生長的影響，可以與對(duì)照濾筒比較而做出判斷，所以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中加菌時(shí)機(jī)與方式只要與

20、對(duì)照一致即可。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,49,實(shí)驗(yàn)器材,藥品無菌檢查最關(guān)鍵的器材是一次性過濾器，價(jià)格和質(zhì)量影響應(yīng)用。 近期主要考慮安全可靠、使用方便、物美價(jià)廉。 遠(yuǎn)期應(yīng)進(jìn)一步考慮低殘留、低吸附等。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,50,實(shí)驗(yàn)器材,關(guān)于實(shí)驗(yàn)器材問題，我們認(rèn)為引入競(jìng)爭(zhēng)、改進(jìn)設(shè)計(jì)、推廣應(yīng)用，使產(chǎn)量、質(zhì)量和用量穩(wěn)步增長，成本和價(jià)格下降，使用戶和企業(yè)雙贏，有利于促進(jìn)無菌檢查方法更加規(guī)范和科學(xué)。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,51,2、微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn),樣品 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液（同無菌檢查） 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 控制菌檢查的驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)器材,20

21、20/8/2,中國藥品生物制品檢定所,52,首先應(yīng)是合格的樣品。,微生物限度檢查樣品,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,53,微生物限度檢查樣品,樣品給藥途徑和類型決定何種控制菌檢查驗(yàn)證 一般口服制劑驗(yàn)證大腸埃希菌 外用制劑驗(yàn)證金葡和銅綠假單胞 含藥材原粉；含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑的大腸菌群檢查驗(yàn)證,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,54,抽樣量和檢驗(yàn)量分別單列一項(xiàng)。 抽樣量 一般抽樣量為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝）的3倍。 檢驗(yàn)量 指供試品一次檢驗(yàn)的用量。一般為10g或10ml；化學(xué)藥膜劑為100cm2；貴重或微量包裝的藥品可酌減（不得少于3g）。檢查沙門菌的供試品其檢驗(yàn)

22、量改為10g或10ml。 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按檢驗(yàn)量執(zhí)行。,微生物限度檢查樣品,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,55,微生物限度檢查樣品,制劑形式多樣，決定前處理各異 難溶固體制劑 非水溶性制劑 軟膏、油膏 栓劑等,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,56,供試液的制備 制備供試液所用的乳化劑、分散劑、中和劑及其用量應(yīng)驗(yàn)證，在該檢驗(yàn)條件無抗菌作用。 7類供試品供試液的制備，其中增訂：,微生物限度檢查樣品前處理,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,57,非水溶性供試品 司盤80、單硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80 供試品10g，20ml無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠，必要時(shí)再加適量十四烷酸

23、異丙酯，充分振搖，使供試品溶解。然后加45100ml pH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液，振搖5-10分鐘，萃取，待油水分層后，取水層作為1：10供試液。,微生物限度檢查樣品前處理,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,58,非水溶性膜劑供試品 二部未變動(dòng)，化學(xué)藥膜劑取100cm2，剪碎，加100ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，浸泡，振搖，作供試液。一部中藥膜劑取50 cm2，剪碎，加適量的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液（50或100ml）浸泡，振搖，以供試品浸液為供試液。（SOP 2000版規(guī)定:中藥膜劑取30-50cm2 ，剪碎，加水100ml）。,微生物限度檢查樣品前處理,2020

24、/8/2,中國藥品生物制品檢定所,59,腸溶及結(jié)腸溶制劑 供試品10g，加100ml pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（結(jié)腸制劑）,于45水浴振搖，使溶解。,微生物限度檢查樣品前處理,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,60,氣霧劑、噴霧劑供試品 取規(guī)定量供試品，置冷凍室冷凍1h，取出，迅速消毒供試品開啟部位周圍，用無菌鋼錐鉆一小孔，放置室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑全部拋出。以無菌注射器吸出全部藥液，按標(biāo)示量加稀釋劑至足量（若含非水溶性成份，加適量無菌聚山梨酯-80液），使勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成110的供試液。,微生物限度檢查樣

25、品前處理,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,61,具抑菌活性的供試品 供試品接種至較大量的培養(yǎng)基中。1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿；控制菌檢查，可加大增菌培養(yǎng)基的用量，或采用薄膜過濾法。 離心集菌法 薄膜過濾法,微生物限度檢查樣品前處理,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,62,微生物限度檢查樣品前處理,很有用處的低速離心法 （500r/min X 5min） 阿奇霉素緩釋干混懸劑 紅霉素片,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,63,微生物限度檢查樣品前處理,制劑形式多樣，決定前處理各異 目標(biāo)是使不便于取樣的供試品分散均勻！,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,64,

26、微生物限度檢查法驗(yàn)證,細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 定量回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 控制菌檢查方法驗(yàn)證 定性能否生長、專屬性實(shí)驗(yàn),2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,65,在建立供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對(duì)檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)做規(guī)定菌的回收試驗(yàn)，以判斷供試品是否具有抗菌活性的實(shí)驗(yàn)方法。,回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn),2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,66,驗(yàn)證用菌株 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念株菌、黑曲霉。 菌液制備（同無菌檢查法）。 取培養(yǎng)物用無菌氯化鈉溶液稀釋成1ml含50100cfu的菌液。,回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn),

27、2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,67,驗(yàn)證方法 試驗(yàn)組 取規(guī)定量最低稀釋級(jí)的供試液，加入50100cfu的菌液，按平板菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)或薄膜過濾計(jì)數(shù)。 菌液組 測(cè)定加入的試驗(yàn)菌液的菌數(shù)。 供試品對(duì)照組 測(cè)定供試品稀釋液（本底）的菌數(shù)。 稀釋劑對(duì)照組 取稀釋液加入50100cfu的菌液，按供試品組供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。 驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)獨(dú)立平行進(jìn)行3次，分別計(jì)算各次試驗(yàn)菌的回收率。,回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn),2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,68,回收率計(jì)算 試驗(yàn)組的菌回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù) 100% 稀釋劑對(duì)照組的菌回收率

28、=（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)）100%,回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn),2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,69,結(jié)果判斷 稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)大于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均大于70%，符合驗(yàn)證試驗(yàn)，可按此方法測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次平行試驗(yàn)中供試品組的菌回收率均小于70%，不符合驗(yàn)證試驗(yàn)，應(yīng)建立新的檢驗(yàn)方法，并重新驗(yàn)證。 驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。,回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn),2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,70,回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn),常規(guī)法（平皿法） 薄膜過濾法,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,71,回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn),常規(guī)法（平皿法） 在

29、采用培養(yǎng)基稀釋法時(shí)，應(yīng)注意避免在注皿前菌液和供試液直接接觸；,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,72,回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn),常規(guī)法（平皿法） 稀釋法（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均應(yīng)加1ml菌液。 培養(yǎng)基稀釋的表示：1:200；1:400；1:1000,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,73,回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn),薄膜過濾法 菌液檢驗(yàn)（計(jì)數(shù)）應(yīng)與供試液同法處理，也要采用薄膜過濾法。,2020/8/2,中國藥品生物制品檢定所,74,在建立供試品的控制菌檢查法或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對(duì)檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)做規(guī)定菌的回收試驗(yàn)，以判斷供試品是否具有抗