1、腫瘤治療相關(guān)基因檢測(cè),2. 腫瘤個(gè)體化治療發(fā)展趨勢(shì),循環(huán)腫瘤細(xì)胞,臨床上治療腫瘤的方法,患者對(duì)藥物是否敏感？毒性是否可耐受？ 患者治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有多高？,個(gè)體化治療：醫(yī)學(xué)概念。應(yīng)用它不僅降低并發(fā)癥的發(fā)生,還降低醫(yī)療費(fèi)用。,腫瘤標(biāo)準(zhǔn)化治療 期患者：手術(shù)/化療 、期患者：放/化療+手術(shù) 局部晚期患者：手術(shù)、化療、放療、靶向,腫瘤個(gè)體化治療 標(biāo)本基因檢測(cè)遺傳特性選擇化療/靶向藥物,病理分型,分子分型,已發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)至少9種EML4-ALK融合基因的突變體：v1、v2、v3a、v3b、v4、v5a、v5b、v6、v7 檢測(cè)方法：RT-PCR, FISH, PCR-測(cè)序等,EML4和ALK兩個(gè)基因分別

2、位于人類(lèi)2號(hào)染色體的p21和p23帶,克唑替尼的靶標(biāo)EML4-ALK融合基因,靶向EGFR的抗腫瘤藥物,類(lèi)別一：小分子酪氨酸激酶抑制劑（ EGFR TKI) 作用機(jī)制：抑制EGFR胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶活性，阻斷EGFR信號(hào)通路； 藥物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄羅替尼（羅氏）。 類(lèi)別二：?jiǎn)慰寺】贵w(mAb) 作用機(jī)制：與EGFR胞外區(qū)結(jié)合，阻斷配體與EGFR的結(jié)合； 藥物代表：西妥昔（默克）；貝伐單抗（羅氏）。,基因EGFR熱點(diǎn)突變位點(diǎn),EGFR主要突變?cè)冢和怙@子18，19，20，21 耐藥突變：T790M,靶向藥物西妥昔單抗靶標(biāo)K-ras基因檢測(cè),NCCN明確指出西妥昔單抗（愛(ài)必妥）用藥之前須

3、檢測(cè)K-ras基因突變檢測(cè)； K-ras突變型患者并不能從抗EGFR治療（愛(ài)必妥）中獲益,反而徒增不良反應(yīng)危險(xiǎn)和治療費(fèi)用； 中國(guó)人群中K-ras基因突變率15% ！ 15%的病人不應(yīng)該使用愛(ài)必妥！,World J Gastroenterol. 2011 November 21; 17(43): 4779-4786.,基因KRAS熱點(diǎn)突變位點(diǎn),10,KRAS主要突變?cè)冢?外顯子2（密碼子12，13 ），3（密碼子61）,個(gè)體化檢測(cè)平臺(tái),基因突變檢測(cè) ARMS技術(shù)，測(cè)序等,ARMS技術(shù)普通PCR,等位基因特異性擴(kuò)增法（Allele Specific Amplification，ASA）建立于198

4、9年，是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱(chēng)擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、等位基因特異性PCR（Allele Specific PCR，ASPCR）等。,方法： 2條正向引物（針對(duì)正常DNA，突變DNA） 1條反向引物 2個(gè)平行的PCR反應(yīng) 普通PCR儀,應(yīng)用：對(duì)微量突變進(jìn)行檢測(cè)。,TaqMan-ARMS技術(shù),TaqMan-ARMS探針技術(shù)基于實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)，結(jié)合了ARMS突變富集和Taqman-MGB特異性熒光檢測(cè)兩種技術(shù)。,Taqman-MGB：針對(duì)SNP位點(diǎn)特異性擴(kuò)增的探針，可區(qū)分一個(gè)堿基的突變。,一個(gè)PCR體系中：

5、1對(duì)引物，1條探針 每個(gè)位點(diǎn)需要做至少兩管PCR擴(kuò)增！,SNP位點(diǎn)檢測(cè)應(yīng)用,EGFR基因突變檢測(cè)方法靈敏度的比較,測(cè)序技術(shù)發(fā)展歷程,Sanger Sequencing （1977）,Ion Semiconductor Sequencing （2011）,Next-Gen Sequencing （2005以后）,Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序原理,Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)及芯片,PI芯片：sequence exomes and whole transcriptomes（5Gb）,目前成熟的腫瘤分子靶向藥物敏感性基因檢測(cè),基因表達(dá)量（mRNA）檢測(cè) 指導(dǎo)個(gè)體化化療,可使標(biāo)準(zhǔn)化療方案得

6、到個(gè)體化應(yīng)用,mRNA檢測(cè)主要技術(shù)特色,采用熒光定量PCR技術(shù)，采用內(nèi)參比RNA作為質(zhì)控對(duì)照，應(yīng)用beta-actin作為內(nèi)對(duì)照，定量檢測(cè)檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平。 適用于各種腫瘤組織檢測(cè)，包括石蠟標(biāo)本、穿刺標(biāo)本、冰凍活檢標(biāo)本等。 國(guó)內(nèi)采用校準(zhǔn)RNA（Calibrator RNA）方法進(jìn)行基因表達(dá)定量。,23,基礎(chǔ)：5000例樣本 人種：中國(guó)患者樣本 標(biāo)準(zhǔn)：正態(tài)分布 定位：精確到1% 統(tǒng)計(jì)：p0.05,Q-PCR檢測(cè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù),NCCN 2012年版臨床治療指南明確指出： 患者接受吉西他濱化療前進(jìn)行RRM1 mRNA檢測(cè)可提高治療有效率和患者生存率。,RRM1表達(dá)與吉西他濱療效相關(guān)的臨

7、床數(shù)據(jù),ERCC1表達(dá)與鉑類(lèi)藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù),ERCC1低表達(dá)患者，能從鉑類(lèi)輔助化療中獲益.,BRCA1/2表達(dá)與鉑類(lèi)藥物療效 相關(guān)的臨床數(shù)據(jù),BRCA1過(guò)度表達(dá) 鉑類(lèi)耐藥的預(yù)測(cè)因子 抗微管類(lèi)藥物的敏感因子,28,低TS mRNA水平的腫瘤患者接受氟類(lèi)化療的效果較好，中位生存期較長(zhǎng)。 TS低表達(dá)的患者對(duì)培美曲賽的療效好。,TS高表達(dá)影響氟類(lèi)和培美曲塞藥效,Shirota Y et al. J Clin Oncol. 2001;19:4298-304,TUBB3高表達(dá)對(duì)紫杉醇和長(zhǎng)春堿類(lèi)不敏感,TUBB3陽(yáng)性表達(dá)是抗微管類(lèi)藥物敏感預(yù)測(cè)因子,30,STMN1表達(dá)檢測(cè)意義,預(yù)后： 表達(dá)水平越高，

8、患者的生存率越低，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)越高。,療效： 低表達(dá)接受長(zhǎng)春瑞濱/順鉑治療的效果較好，中位生存期較長(zhǎng)； STMN1高表達(dá)接受長(zhǎng)春瑞濱/順鉑的療效較差。,Elizabeth A et al. Cancer Res. 2002;62:6864-6869,乳腺癌患者預(yù)后指標(biāo)及曲妥珠單抗治療的靶點(diǎn) 胃癌曲妥珠單抗靶向治療的靶點(diǎn),HER2基因檢測(cè),FDA 2013年關(guān)于胃癌HER2檢測(cè)流程建議,ASCO/CAP2013指南關(guān)于乳腺癌HER2檢測(cè)推薦： IHC檢測(cè)HER2蛋白表達(dá)水平 FISH檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增,靶向藥物敏感性解決方案,化療藥物敏感性解決方案,循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）檢測(cè),1869年

9、 Aust Med J，Ashworth最早在轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中觀察到。 2005年 N Engl J Med，Cristofanilli證實(shí)治療前CTC數(shù)目是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。,循環(huán)腫瘤細(xì)胞指從實(shí)體瘤中脫離出來(lái)并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。,循環(huán)腫瘤細(xì)胞,循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）檢測(cè),全球唯一一個(gè)獲得FDA和SFDA認(rèn)證的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng),(Circulating Tumor Cell),強(qiáng)生CellSearch系統(tǒng)國(guó)內(nèi)注冊(cè)情況,如何鑒別出CTC?,CTC,Anti-EpCAM磁珠,Anti-CK-PE,Nucleus DAPI,CK,EpCAM,在C

10、ellSearch檢測(cè)中，CTC 被設(shè)定為： EpCam （上皮來(lái)源細(xì)胞表面抗原） CK-8,18 和/或19 （腫瘤細(xì)胞表面抗原） DAPI （細(xì)胞核染料） CD45 （白細(xì)胞表面抗原）,+ + + -,CTC數(shù)量與無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的關(guān)系,化療后CTC數(shù)量少于閾值的患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期明顯高于CTC數(shù)量大于閾值的患者。 化療前后CTC數(shù)量都少于閾值 的患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期明顯高于只有一次測(cè)出CTC數(shù)量少于閾值的患者。,乳腺癌閾值5，結(jié)直腸癌閾值3，前列腺癌閾值5,為什么要選擇使用CTC系統(tǒng)? 唯一的標(biāo)準(zhǔn)化，自動(dòng)化循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng) 具可重復(fù)性和高敏感度 系統(tǒng)最低檢測(cè)限度：

11、7.5ml外周血中的1個(gè)腫瘤細(xì)胞 臨床意義 預(yù)測(cè)無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期 轉(zhuǎn)移性癌癥的監(jiān)護(hù) 療效監(jiān)控 復(fù)查（早于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展情況）,CTC檢測(cè)樣本,使用CellSave儲(chǔ)存管采集靜脈血液標(biāo)本10ml 輕輕顛倒8次，防止凝塊 樣本室溫條件(15-30攝氏度)下96小時(shí)之內(nèi)接受處理 接受阿霉素治療的患者給藥之后，至少需要等待7天 術(shù)后15天以后,樣本溶血及結(jié)塊不能用于CTC檢測(cè)！,送檢樣本要求,腫瘤個(gè)體化用藥是發(fā)展趨勢(shì) 腫瘤個(gè)體化用藥分子靶標(biāo)及靶向藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)聯(lián)研究越來(lái)越多 部分基因檢測(cè)近年已逐步在臨床推廣 比較完整的個(gè)體化診療解決方案逐步誕生,結(jié) 語(yǔ),腫瘤個(gè)體化治療發(fā)展趨勢(shì),為什么要做分子檢測(cè)？,腫瘤分子分型時(shí)代要到來(lái)？,在美國(guó)華盛頓大學(xué)，Lukas Wartman醫(yī)生患上了成人急性淋巴細(xì)胞白血病。 Lukas的病情很快