ics65.120

B46

石黔

中華人民共和國國家標準

GB/T14700一2002

代替GB/T14700-1993

飼料中維生素B:的測定

DeterminationofvitaminB1infeeds

2002一10一31發(fā)布2003一04一01實施

中華人民共和國

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局

發(fā)布

GB/T14700--2002

pU呂

本標準修訂了GB/T14700-1993《飼料中維生素B的測定》，修訂后的方法具有適用范圍廣、檢測

限低、高效、快捷、準確的特點。本標準參考了美國“化學分析協(xié)會”第六十七期發(fā)表的《復(fù)合預(yù)混合飼料

中抗壞血酸、煙酞胺、毗哆醇、硫胺素及核黃素的液相色譜分析方法》和美國公職分析化學家協(xié)會(1990

版)((食物和維生素制品中的硫胺素熒光測定法》而制定。

本標準與GB/T14700-1993的主要技術(shù)差異:本標準規(guī)定了兩種方法，方法I為熒光分光光度

法，保留GB/T14700-1993的全部內(nèi)容;在范圍中補充了復(fù)合預(yù)混合飼料;將重復(fù)性允許差“相對相

差”改為“相對偏差”;方法2為高效液相色譜法.確定了試樣的提取條件、色譜條件及重復(fù)性要求，并確

定了該法適用于維生素B,含量大于20mg瓜g的復(fù)合預(yù)混合飼料及維生素預(yù)混合飼料。

本標準規(guī)定了熒光分光光度法為仲裁法。

本標準由全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會提出并歸口。

本標準起草單位國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(北京)

本標準主要起草人:李蘭、陳必芳、索德成。

本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為:GB/T14700-1993

GB/T14700-2002

飼料中維生素B1的測定

范圍

本標準規(guī)定了用熒光分光光度儀和高效液相色譜儀測定飼料中維生素B,(硫胺素)含量的兩種

方法。

本標準規(guī)定的方法1適用于飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合飼料中

的維生素B，的測定。萃取液的溶液范圍為。02pg/mL-0.2pg/mL(在有吸附硫胺素或影響硫色素熒

光干擾物質(zhì)存在的情況，本方法不適用)

本標準規(guī)定的方法2適用于維生素B,含量大于20mg/kg的復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合飼料

的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的

修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準。然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是

否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T14699.1飼料采樣方法

3方法1熒光分光光度法(仲裁法)

3.1原理

試樣中的維生素B,(即硫胺素C,3HON,SCL)經(jīng)稀酸消化、酶分解、吸附劑的吸附分離提純后，在

堿性條件下被鐵氰化鉀氧化生成熒光色素—硫色素，用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的熒光強度與

試樣中維生素B的含量成正比，依此進行定量測定。

3.2試劑和溶液

除非另有說明，所用試劑均為分析純的試劑，水為蒸餾水，符合GB/T6682中3級用水或相當純度

的水。

3.2.1鹽酸溶液

c(HCI)=0.1mot/L.

3.2.2硫酸溶液

c(1/2H2S0,)=0.05mol/I。

3.2.3乙酸鈉溶液

c(CH3000Na)=2.0mol/L:取164g無水乙酸鈉或272g結(jié)晶乙酸鈉(CH3000Na·3H,O)溶于

水，稀釋至1000mL,

3.2.4淀粉酶懸浮液

100g/L:用乙酸鈉溶液((3-2-3)懸浮10g淀粉酶制劑(活性1:250,Takadiastase，或相當活性的其

他磷酸醋酶)，稀釋至100mL，使用當日制備。

3.2.5氮化鉀溶液

GB/T14700-2002

250g/I。

3.2.6酸性點化鉀溶液

將8.5ml,濃鹽酸加人至氯化鉀溶液((3-2-5)中，并稀釋至1000ml

3-2.7氫氧化鈉溶液

150g/Lo

3.2.8鐵抓化鉀溶液

10g/L,

3.2.9堿性鐵橄化鉀溶液

4.00mL的鐵氰化鉀溶液((3.2.8)與氫氧化鈉溶液(3.2.7)混合使之成100MI，此液4h內(nèi)使用。

3.2.10冰乙酸溶液

30mL/L(V,-V2)

3.2.11人造沸石

60目~8。目，使用前應(yīng)活化，方法如下:將適量人造石置于大燒杯中，加人10倍容積的熱乙酸溶液

(3.2.10)，用玻璃棒均勻攪動10min，使沸石在乙酸溶液中懸浮，待沸石沉降后，棄去上層乙酸液，重復(fù)

上述操作兩次。換用5倍其容積的熱氯化鉀溶液(3.2.5)攪動清洗兩次，每次15min。再用熱乙酸溶液

洗10min。最后用熱蒸餾水清洗沸石至無氯離子(用10g/L硝酸銀水溶液檢驗)。用布氏漏斗抽濾，

100C烘干，貯于磨口瓶中備用。

使用前，檢查沸石對維生素B,標準溶液的回收率，如達不到9200，須重新活化沸石。

3.2.12維生素B，標準溶液

3.2.12.1維生素B,貯備液I:鹽酸硫胺素純品(中國藥典參照標準)，于五氧化二磷干燥器中干燥

24h，稱取0.0500g,溶解于pH3.5-4.3的200o(V,-V2)乙醇溶液中并定容至500mL，盛于棕色瓶

中4℃冰箱保存，保存期3個月。該溶液含。.1mg/ml維生素B。

3-2-12.2維生素B,貯備液ll:取維生素B,貯備液工((3.2.12.1)10mL用酸性20%乙醇溶液定容至

100mL,盛于棕色瓶中4C冰箱保存，保存期1個月。該溶液含10Icg/mL維生素B,.

3.2.12.3維生素B,標準工作液:取貯備液1(3.2.12.2)2ml與65mI鹽酸溶液((3.2.1)和5ml_乙

酸鈉溶液((3.2.3)混合，用水定容至100mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。該溶液含。.2Ig/m工維生素B

3.2-13硫酸奎寧溶液

3.2.13.1硫酸奎寧貯備液:稱取硫酸奎寧0.1000g，用硫酸((3-2-2)溶解并定容至1000ml貯于棕

色瓶中冰箱4C保存。若溶液混濁則需重新配制。

3.2.13.2硫酸奎寧工作液:取貯備液((3.2.13.03mL，用硫酸((3.2.2)定容至1000MI。貯于棕色瓶

中，冰箱4C保存。該溶液含。.3pg/mL硫酸奎寧。

3.2-14正丁醇

其熒光強度不超過硫酸奎寧工作液的4%，否則需用全玻璃蒸餾器重蒸餾，取114-C-118C餾份。

3.2.15無水硫酸鈉

3.3儀器、設(shè)備

3.3門熒光分光光度計，備1cm石英比色杯。

3.3.2電熱恒溫水浴。

3.3.3電熱恒溫箱。

3.3.4實驗室用樣品粉碎機。

3.3.5分析天平感量0.0001ge

3.3.6注射器:10mL,

3.3.7吸附分離柱:全長235mm，外徑X長度如下:上端貯液槽容量約為50m工35mmX70mm;中

部吸附管8mmX130mm;下端35mm拉成毛細管。

GB/T14700-2002

3.3.8反應(yīng)瓶，具塞離心管25m工

3.4試樣的制備

按GB/T14699.1飼料采樣方法采樣，選取有代表性的飼料樣品，至少500g，四分法縮減至100g,

磨碎，通過。.28mm孔篩，混勻，裝人密閉容器中，避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

35分析步驟

3.5.1稱樣

稱取原料配合飼料、濃縮飼料或復(fù)合預(yù)混合飼料lg-2g(約含維生素B,4kg-20pg),精確至

。001g;維生素預(yù)混合飼料稱取。.25g-0.50g，精確至。.0001g，置于100mL容量瓶中。

3.5.2試樣溶液的制備

3.5-2,1水解:將鹽酸(3.2.1)65ml加人盛有試樣(3.5.1)容量瓶中，經(jīng)沸水浴加熱30min(或于

121C-123015kg高壓釜中加熱30min)，開始加熱5min-10min內(nèi)不時搖動容量瓶，以防結(jié)塊。

3.5-2.2酶解”，冷卻容量瓶至50C以下，加5ml淀粉酶懸浮液((3.2.4),搖勻該試液的pH約為4.0

-4.5，將容量瓶于45C-50'C恒溫箱中保溫3h，取出冷卻調(diào)整pH至3.5，用水稀釋至100mL,

3.5-2.3過濾:將試液通過無灰濾紙過濾棄去初濾液5mL，收集濾液于錐形瓶中。預(yù)混料提取液需逐

級稀釋，使之含維生素B、約為。.2Kg/m工，作為試樣溶液。

15.3試樣溶液的提純

3.5-3.1制備吸附柱:取1.5g活化人造沸石((3.2.11)置于50mL小燒杯中，加人3%乙酸溶液

(3.2.10)浸泡。將脫脂棉置于吸附柱底部，用玻璃棒輕壓然后將乙酸浸泡的沸石全部洗人柱中(勿使

吸附柱脫水)，過柱流速小于等于1mL/min為宜。再用10mL近沸的水洗柱一次。

3.5.3.2吸25mL試樣溶液((3.5.2.3)，慢慢加人制備好的吸附柱中，棄去濾液，用每份5ml近沸的

水洗柱三次，棄去洗液。

3-5-3.3用25mL60C^-70C酸性氯化鉀((3-2-6)分三次連續(xù)加人吸附柱，收集洗脫液于25mL容量

瓶中，冷卻后用酸性氯化鉀定容，混勻。

3.5.34同時用25mL維生素B標準工作液((3.2.12.3)0重復(fù)3.5-3.1-3-5.3.3操作，作為外標

3.5.4氧化與萃取

注意:以下操作避光進行。

3.5-4.，于兩只反應(yīng)管中各吸人5m工_洗脫液(3.5-3-3)，記作A,Be

3.54.2向B管加3mL氫氧化鈉溶液(3.2.7)，再向A管中加3ml氧化劑堿性鐵氰化鉀溶液

(3.2.9)，輕輕旋搖依次立即向A管加人15MI_正丁醇(3.2.14功A塞，劇烈地振搖15s，再向B管加人

15ml一正丁醇加塞。共同振搖90s，靜置分層

3.5-4.3用注射器吸去下層水相，向各反應(yīng)管加人約2g無水硫酸鈉((3-2-15)，旋搖，待測。

3.5.4.4同時將5ml作為外標的洗脫液((3.5.3.4)，置人另兩只反應(yīng)管，相應(yīng)地記作C,n，按3.5.4.1

一3.5.4.3操作。

35.5測定

3.5.5.1用硫酸奎寧工作液(3.2.13.2)調(diào)整熒光儀，使其穩(wěn)定于一定數(shù)值，作為儀器工作的固定條件。

3-5-5.2于激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長435nm處測定各反應(yīng)管中萃取液((3-5.4-3)和((3-5.4-4)的熒

光強度。

;卜:

結(jié)果計算

計算公式:試樣中維生素s:含量按式(ll計算:

V。V

xcx*-.'x一‘??。，‘·‘。.。。。。。。。二。。。。。(1、

v,m

T一T

T一T

一一

1)測定預(yù)混合飼料時，可省略酶解。

GB/T14700-2002

式中:

?！嚇又芯S生素B，的含量，單位為毫克每千克(mg/kg);

T,一一A管試液的熒光強度;

了-B管試液空白的熒光強度;

T,-C管標準溶液的熒光強度;

了一一D管標準溶液空白的熒光強度;

。—維生素B、標準工作液濃度，單位為微克每毫升(pg/-L);

V一一提取液總體積，單位為毫升(mL);

V—分取溶液過柱的體積，單位為毫升(mL);

Vz—酸性氯化鉀洗脫液體積，單位為毫升(mL);

m一一試樣質(zhì)量，單位為克(9)。

3.6.2平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留有效數(shù)字3位。

3.7重復(fù)性

同一分析者對同一試樣同時或快速連續(xù)進行兩次測定，所得結(jié)果的相對偏差:

維生素B含量//(mg/kg)相對偏差/(%)

<5.0(士15

)5.0鎮(zhèn)士10

>50毛士5

方法2高效液相色譜法

4門原理

試樣中維生素B,經(jīng)酸性提取液超聲提取后，將過濾離心后的試樣溶液注人高效液相色譜儀反相色

譜系統(tǒng)中進行分離，用紫外(或二極管矩陣檢測器)檢測，外標法計算維生素B:的含量。

4.2試劑和溶液

除特殊說明外，所用試劑均為分析純，水為蒸餾水，色譜用水為去離子水，符合GB/T6682中1級

用水規(guī)定。

4.2.1乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)

優(yōu)級純。

4.2.2庚烷磺酸鈉(PICB7)

優(yōu)級純。

4.2.3冰乙酸

優(yōu)級純。

4.2.4三乙胺

色譜純。

4.2.5甲醇

色譜純

4.2-6乙醇溶液

250o(V,--V)

4.2.7提取液

在已裝人約700m工去離子水的1000ml容量瓶中，加人50mgEDTA(4.2.1)待全部溶解后，加

人25ml冰乙酸(4.2.3),5ml三乙胺((4.2-4)，用去離子水定容至刻度搖勻。取860ml_上述溶液與

140ml甲醇(4.2.5)混合即得

4.2.8流動相

GB/T14700-2002

在已裝人約700mL去離子水的1000mL容量瓶中，加入50mgEDTA(4.2.1)精確至。.001g,

1.1g庚烷磺酸鈉((4.2.2)精確至。.001g，待全部溶解后加人25ml冰乙酸((4.2.3),5m工三乙胺

(4.2.4)，用去離子水定容至刻度搖勻。用冰乙酸、三乙胺調(diào)節(jié)該溶液pH至3.40士。.02，過。.45pm濾

膜。取該溶液860mL與140ml甲醇(4-2.5)混合，超聲脫氣，待用。

4.2.9維生素B:標準溶液

4.2.9.1維生素B:標準貯備液:準確稱取維生素B,0.0500g于100ml棕色容量瓶中.加乙醇溶液

(4.2.6)超聲15min，待全部溶解后，用乙醇溶液定容至刻度。此溶液濃度為500I-g/ml，置4C'冰箱保

存，保存期3個月

4.2.9.2維生素B,標準工作液A:準確吸取2.00ml維生素B，標準貯備液A(4.2.9.1)于50m工棕

色容量瓶中，用流動相((4.2.8)定容至刻度，該標準工作液濃度為20Kg/mL.

4.2-9.3維生素B,標準工作液B:準確吸取5.00ml維生素B,標準T一作液((4.2.9.2)于50ml棕色

容量瓶中，用流動相((4-2-8)定容至刻度，該標準工作液濃度為2.0pg/mL.

注維生素BI標準工作液A和B液單獨配制時在4℃冰箱中可保存一周;與其他維生素配制混合標準時在4C冰

箱中最多保存兩天。

4.3儀器、設(shè)備

4.3.1實驗室常用玻璃器皿。

4.3.2pH計(帶溫控，精確至。.01).

4.3.3超聲波提取器。

4.3.4針頭過濾器，備?！?5pm(或。，2pin)濾膜

4.3.5高效液相色譜儀，帶紫外或二極管矩陣檢測器。

4.4試樣的制備

按GB/T14699.1采樣，選取有代表性的飼料樣品至少500g，四分法縮減至100g,磨碎，全部通過

0.28mm孔篩，混勻，裝人密閉容器中，避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

4.5分析步驟

注意:以下操恢避光進行

4.5門試樣溶液的制備

稱取維生素預(yù)混合飼料。.25g-0.50g,精確至。.0001g;復(fù)合預(yù)混合飼料1g-3g,精確至

0.001g，置于100m1棕色容量瓶中，加人三分之二體積的提取液((4.2.7)，在超聲波提取器(4-3.3)中

超聲提取20min(中間旋搖一次以防樣品附著瓶底)，待溫度降至室溫后用提取液定容至刻度，過濾，濾

液過0.45pm(或。.2Km)濾膜，待上機。

4-5.2測定

4.5.2.1高效液相色譜條件

色譜柱長150mm，內(nèi)徑3.9mm，不銹鋼柱。

固定相:NoVa-pakC,a,粒度4pm，