1、大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞-集落刺激因子包涵體的復(fù)性與純化,創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)I-化學(xué)生物學(xué),課程組 王驪麗,實(shí)驗(yàn)四,基因工程操作：基因擴(kuò)增、表達(dá)；原核細(xì)胞；包涵體的形成與特點(diǎn)。 重組蛋白分離純化：細(xì)胞收集 、破碎；包涵體的溶解； 蛋白質(zhì)變性、復(fù)性：稀釋法、透析法、蛋白質(zhì)折疊液相色譜法； 蛋白質(zhì)構(gòu)象的表征：包涵體構(gòu)象變化、圓二色譜法,實(shí)驗(yàn)技能訓(xùn)練要點(diǎn),主要新知識(shí),儀器分析：色譜技術(shù) 液相色譜技術(shù) 儀器分析：光譜技術(shù)-熒光光譜、核磁共振 化學(xué)生物學(xué)導(dǎo)論：蛋白質(zhì)、酶 蛋白質(zhì)與酶化學(xué)：重組DNA技術(shù) 蛋白質(zhì)純化與表征：液相色譜法、蛋白質(zhì)構(gòu)象表征. 有機(jī)化學(xué)：熒光探針,實(shí)驗(yàn)技能訓(xùn)練要點(diǎn),主要知識(shí)回顧,背景知識(shí),實(shí)

2、驗(yàn)室研發(fā)從E.coli 中得到一個(gè)具有活性的治療用藥物蛋白或者研究用蛋白純品，包括以下步驟： 目的基因DNA片段的獲得；E.coli 重組表達(dá)載體的構(gòu)建；在E.coli 中對(duì)目的基因進(jìn)行表達(dá)；目的蛋白從E.coli 裂解液中的純化；規(guī)?；a(chǎn)工藝（包括工程菌發(fā)酵、復(fù)性與純化工藝的放大等）的建立。,關(guān)鍵詞：重組人粒細(xì)胞-集落刺激因子、液相色譜復(fù)性與純化 Recombinant human granulocyte colony stimulating factor, Renaturation and purification by liquid chromatography,實(shí)例：粒細(xì)胞白血病,人

3、粒細(xì)胞-集落刺激因子對(duì)造血系統(tǒng)的調(diào)控作用,HSC,CLP,CMP,GMP,MEP,Pro-T,Pro-B,T,B,NK,單核細(xì)胞,粒細(xì)胞,巨核細(xì)胞,紅細(xì)胞,SCF;IL-2,SCF EPO,SCF,SCF,SCF,SCF,IFN-,SCF,基質(zhì)細(xì)胞,SCF,rhG-CSF的理化性能與生物學(xué)功能,幾種PFLC法復(fù)性與純化rhG-CSF包涵體結(jié)果比較,西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容提要,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握包涵體的變性、復(fù)性的基本原理； 熟練掌握復(fù)性與純化后蛋白質(zhì)的表征和鑒定方法； 熟練掌握蛋白質(zhì)含量測(cè)定和蛋白質(zhì)構(gòu)象的表征。,通過人粒細(xì)胞-集落刺激因子(GC-CSF)基因擴(kuò)增和在大腸桿菌DH5

4、中重組包涵體蛋白表達(dá)、復(fù)性的實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生了解大腸桿菌包涵體形成和特點(diǎn);了解二硫鍵形成與構(gòu)象的關(guān)系；,基因工程技術(shù)是指人們按照自己的愿望，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)移等技術(shù)，有目的地改造生物物種，使現(xiàn)有物種出現(xiàn)人類需要的性狀的技術(shù); 以大腸桿菌克隆表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的原核基因工程技術(shù)，使得人們可以在大腸桿菌中高效表達(dá)出幾乎任何一種有理論和應(yīng)用價(jià)值的蛋白。,二、實(shí)驗(yàn)原理-基因工程技術(shù),大腸桿菌中高效表達(dá)的蛋白，常常以不可溶解包涵體存在； 包涵體是由錯(cuò)誤折疊的多肽形成的致密、非晶體性的蛋白沉淀物，其一級(jí)結(jié)構(gòu)（即氨基酸序列）是正確的，立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤，所以沒有生物活性； 包涵體能夠溶解于強(qiáng)的變性劑，如8 mol

5、/L脲或6-7mol/L鹽酸胍溶液中。,二、實(shí)驗(yàn)原理包涵體的形成和特點(diǎn),直接稀釋法（Direct dilution），包括透析法和超濾法 液相色譜復(fù)性法（Chromatographic methods for protein refolding） 人工配基輔助的蛋白復(fù)性（Artificial molecular chaperone assisted protein refolding),二、實(shí)驗(yàn)原理體外復(fù)性的主要途徑,液相色譜復(fù)性蛋白的過程,蛋白質(zhì)被可逆地吸附在固定相以單個(gè)分子存在，從而實(shí)現(xiàn)單個(gè)分子相互分離，并抑制聚集產(chǎn)生，合適的流動(dòng)相將蛋白分子從固定相上洗脫。,西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,三

6、、實(shí)驗(yàn)試劑和儀器,尿素（成都金山化學(xué)試劑廠），乙腈（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；三氟醋酸（分析純，F(xiàn)luka公司）；硫酸銨、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、濃鹽酸等均為分析純（西安化學(xué)試劑廠）。-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）均購自Sigma公司（St. Louse，MO，美國）。,試劑,三、實(shí)驗(yàn)試劑和儀器,純水儀,離心機(jī),二氧化碳培養(yǎng)箱,快速蛋白純化儀,日立F-4500熒光光譜儀,儀器,環(huán)節(jié)1,環(huán)節(jié)2,環(huán)節(jié)3,四、實(shí)驗(yàn)步驟與方法實(shí)驗(yàn)天數(shù),四、實(shí)驗(yàn)步驟與方法,四、實(shí)驗(yàn)步驟與方法-流動(dòng)相組成,普通SEC：0.15 mol/L NaCl ，3.0 mol/L urea ，0.05 mol

7、/L Tris-HCl ，1mmol/L EDTA + 1.0 mmol/L，pH8.0 GSH/0.1mmol/L GSSG ，15%甘油; 脲梯度SEC：A為 0.05 mol/L Tris (pH 8.0) ，1.0 m mol/L EDTA ， 0.15 mol/L NaCl ，2.5 mmol/L GSH + 0.8 mmol/L；B為 8.0 mol/L urea。,1、普通SEC法對(duì)hG-CSF復(fù)性與純化,流動(dòng)相平衡Superdex 75(16/20)柱子，然后將200 L 8.0 mol/L脲溶解變性的rhG-CSF溶液直接進(jìn)樣到平衡好的色譜柱中，用平衡時(shí)所用的流動(dòng)相洗脫復(fù)性的

8、rhG-CSF。 流速1.0 4.0 mL/min，檢測(cè)波長為280 nm。 收集復(fù)性的rhG-CSF餾分，測(cè)定蛋白濃度。 將收集液用稀鹽酸將其pH調(diào)至4.0，然后對(duì)儲(chǔ)存液10.0 mmol/L NaAc緩沖液(pH 4.0)透析，透析后的含rhG-CSF的溶液用于測(cè)定生物活性。,2、脲梯度SEC復(fù)性rhG-CSF,用流動(dòng)相A和B按一定比例的混合液平衡色譜柱，然后在10或者15 mL內(nèi)將B液濃度增至100%。按上述方法平衡后，將不同體積還原變性的rhG-CSF直接進(jìn)入SEC色譜柱，然后以2.0 mL/min的流速用B液洗脫。檢測(cè)波長280 nm。 收集復(fù)性的rhG-CSF，用稀鹽酸將其pH調(diào)至

9、4.0，然后對(duì)儲(chǔ)存液10.0 mmol/L 醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）透析。透析后的含rhG-CSF的溶液用來測(cè)定蛋白濃度和生物活性。,優(yōu)化的條件下復(fù)性與純化,普通SEC法：流動(dòng)相為 0.15 mol/L NaCl , 0.05 mol/L Tris, 1.0 mmol/L EDTA, 2.5 mmol/L GSH ,0.8 mmol/L GSSG , 3.0 mol/L urea ,15% 甘油 (v/v) ，pH 8.0 ； 脲梯度SEC法：流動(dòng)相為 0.15 mol/L NaCl , 0.05 mol/L Tris,1.0 mmol/LEDTA ,2.5 mmol/L GSH ,0.8

10、 mmol/L GSSG ,15% 甘油 (體積比)，pH 8.0；流動(dòng)相B：流動(dòng)相A+ 8.0 mol/L 脲 流速為2.0 mL/min, 檢測(cè)波長280nm,rhG-CSF的SEC復(fù)性與同時(shí)純化產(chǎn)物色譜圖； 復(fù)性與純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析圖； 紫外分光光度法測(cè)定復(fù)性與純化產(chǎn)物含量結(jié)果； 熒光光譜表征復(fù)性前后的構(gòu)象；,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論,SEC復(fù)性rhG-CSF的色譜圖,實(shí)線代表rhG-CSF的洗脫曲線，* 表示復(fù)性的 rhG-CSF,脲梯度SEC復(fù)性rhG-CSF的色譜圖,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論-色譜圖,1 2 3,1, rhG-CSF 包涵體提取液; 2, 分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(從底部到頂部

11、依次為14,400; 20,100; 31,000; 43,000; 66,200; 97,400 Dalton); 3, SEC復(fù)性并部分純化后的rhG-CSF,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論-電泳分析,脲梯度SEC和普通SEC對(duì)rhG-CSF復(fù)性的比較,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論-對(duì)比分析,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論-蛋白的構(gòu)象表征,圓二色譜法,熒光光譜法,使用超聲波時(shí)應(yīng)控制強(qiáng)度在一定的限度，即剛好低于溶液產(chǎn)生泡沫的水平。產(chǎn)生泡沫會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。 樣品加上上樣緩沖液煮沸后，一定要進(jìn)行離心，以除去顆粒物質(zhì)。 電泳上樣時(shí)要小心，不要污染旁邊的泳道。 在復(fù)性蛋白時(shí)，要注意一定要緩慢加入包涵體復(fù)性緩沖液，以防止變化太快造成

12、蛋白質(zhì)聚集析出。,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論-注意事項(xiàng),六、實(shí)驗(yàn)延伸-二硫鍵對(duì)接,Zhang L, Chou CP, Moo-Young M. Disulfide bond formation and its impact on the biological activity and stability of recombinant therapeutic proteins produced by Escherichia coli expression system. Biotechnol Adv 2011; 29:9239,最具有代表性的是多維能量景觀學(xué)說（multidimensional ener

13、gy landscape)和折疊漏斗(folding funnel)模型。這兩種機(jī)制都可以很好地預(yù)測(cè)蛋白的復(fù)性路徑。,蛋白折疊的漏斗形能量景觀圖,六、實(shí)驗(yàn)延伸-蛋白質(zhì)折疊機(jī)制,實(shí)時(shí)核磁共振光譜可用來跟蹤蛋白的折疊反應(yīng),六、實(shí)驗(yàn)延伸-蛋白折疊研究新技術(shù),思考題,蛋白質(zhì)的CD光譜與其分子構(gòu)象有何關(guān)系？圓二色性光譜法可以為蛋白質(zhì)分子構(gòu)象提供哪些信息？ 蛋白質(zhì)的紫外光譜與其分子構(gòu)象有何關(guān)系？該方法可以為蛋白質(zhì)分子構(gòu)象提供哪些信息？ 你能否通過關(guān)鍵詞，查閱和設(shè)計(jì)一個(gè)有功能細(xì)胞因子從基因克隆、表達(dá)與復(fù)性的實(shí)驗(yàn)？,參考文獻(xiàn),Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation wi

14、th simultaneous purification of rhG-CSF from Escherichia coli by ion exchange chromatography.Biome Chromatogr., 2007,21: 1291-1296 Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor produced from Escherichia coli using size exclusion chromatography, J Liquid Chromatogr. 12(2):202-207. Singh SM, Panda AK. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng, 2005, 99(4): 303-310. Geng XD, Wang CZ. Protein folding liquid chromatography and its recent d