1、1.2 基因工程的基本操作程序,1,2,3,步驟一：目的基因的獲取,目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。,如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，植物的抗逆性相關(guān)的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。,從已有的物種中分離 人工方法合成,從基因文庫獲得,4,1、從基因文庫中獲取目的基因,基因文庫: 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(gene library)。 基因組文庫: 基因文庫中包含了一種生物所有的基因，這種基因文庫叫做基因組文庫。 部分基因文庫: 基因文庫中包含了一種生物的一部分基

2、因，這種基因文庫叫做部分基因文庫。,5,6,某生物體內(nèi)全部DNA,許多DNA片段,受體菌群體,基因組文庫,某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNA,cDNA,受體菌群體,部分基因文庫 （cDNA文庫）,7,外顯子,內(nèi)含子,原核生物基因,真核生物基因,內(nèi)含子,外顯子,8,真核生物cDNA文庫與的區(qū)別基因組文庫,小,大,無,有,無,有,某種生物部分基因,某種生物全部基因,可以,部分基因可以,9,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)?？梢垣@得大量的目的基因。,10,循環(huán)（重復(fù)）,使目的基因短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增,11,PCR技術(shù)的原理：DNA復(fù)制(體外),過程

3、：變性 退火 延伸,（解鏈為單鏈） （冷卻） （子鏈合成）,條件： 引物（2種）； 模板:DNA的兩條鏈； 四種脫氧核苷酸； 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。,多次重復(fù),12,PCR技術(shù)與DNA體內(nèi)復(fù)制的區(qū)別：,需要,需要,常溫條件、解旋酶、ATP,高溫條件（9095）,DNA解旋酶、DNA聚合酶、,耐高溫的Taq酶,體內(nèi)（細(xì)胞內(nèi)）,體外,13,練習(xí)有關(guān)PCR技術(shù)的說法，不正確的是( ） APCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù) BPCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制 C利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 DPCR擴(kuò)增中必須有解旋酶才能解開雙鏈DN

4、A,14,（1）催化過程的酶是_ 。 （2）過程也稱為DNA的變性，此過程在溫度高達(dá)9095時(shí)才能完成，說明DNA分子具有_性。 （3）由圖中信息分析可知，催化過程的酶都是_，兩者在作用特性上的區(qū)別是_ 。 （4）如果RNA單鏈中有堿基100個(gè)，其中A占25%，U占15%，則通過該過程合成的一個(gè)雙鏈DNA片段中有胞嘧啶_個(gè)。,反轉(zhuǎn)錄酶（或逆轉(zhuǎn)錄酶）,練習(xí)：1970年，特明和巴爾的摩證實(shí)了RNA病毒能依賴RNA合成DNA的過程，并發(fā)現(xiàn)了催化此過程的酶。下面為形成cDNA的過程和PCR擴(kuò)增過程示意圖。請(qǐng)根據(jù)圖解回答下列問題：,穩(wěn)定,DNA聚合酶,催化過程的酶耐高溫,60,15,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,

5、mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,推測,推測,目的基因,化學(xué)合成,3. 通過DNA合成儀化學(xué)方法直接人工合成,（基因比較小、核苷酸序列又已知）,16,步驟二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心內(nèi)容）,（1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。 （2）用同一種限制酶切割目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。 （3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。,目的基因與運(yùn)載體結(jié)合的過程實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。,17,步驟二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心內(nèi)容）,獲取目的基因,DNA連接酶,重組DNA,1. 表達(dá)載體的構(gòu)建

6、過程,質(zhì)粒,目的基因與運(yùn)載體結(jié)合的過程實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。,18,步驟二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心內(nèi)容）,2. 表達(dá)載體的組成,啟動(dòng)子：,+,目的基因：,+,終止子：,標(biāo)記基因：,+,是 的結(jié)合位點(diǎn)， 驅(qū)動(dòng) 過程。,RNA聚合酶,轉(zhuǎn)錄,終止 過程。,轉(zhuǎn)錄,有目的基因的受體細(xì)胞。,鑒定和篩選,編碼人類所需的蛋白質(zhì), 使生物表達(dá)相應(yīng)性狀.,復(fù)制原點(diǎn)：,啟動(dòng)復(fù)制,19,質(zhì)粒,DNA分子,限制酶處理,兩個(gè)切口 獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同一種,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,基因表達(dá)載體的組成 復(fù)制原點(diǎn)+啟動(dòng)子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因,20,思考:,1. 上述表

7、達(dá)載體的啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因的化學(xué)成分相同嗎？,都是DNA,2. 終止子和終止密碼的化學(xué)成分是否一致？,終止子DNA, 終止轉(zhuǎn)錄; 終止密碼RNA上，終止翻譯.,21,3. 圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI的酶切位點(diǎn)，ampR為青霉素抗性基因，tctR 為四環(huán)素抗性基因，P啟動(dòng)子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。,據(jù)圖回答： （1）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒該表達(dá)載體分別 用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用連接酶進(jìn)行連接后，其中由 兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有 、

8、 、 三種 。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對(duì)這些連接產(chǎn)物進(jìn) 行 . （2）用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。之后將這些宿主細(xì)胞接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是 ；,目的基因運(yùn)載體連接物,運(yùn)載體運(yùn)載體連接物,目的基因目的基因連接物,分離純化,目的基因運(yùn)載體連接物,運(yùn)載體運(yùn)載體連接物,22,練習(xí). 圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI的酶切位點(diǎn)，ampR為青霉素抗性基因，tctR 為四環(huán)素抗性基因，P啟動(dòng)子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在

9、內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。,（3）目的基因表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)是 ，其合成的產(chǎn)物是 。 （4）在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶 是 。,EcoRI和BamHI,啟動(dòng)子,mRNA,23,常用的受體細(xì)胞：,有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。,步驟三：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,轉(zhuǎn)化： 指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。,24,1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多單子葉植物沒有感

10、染力； （2）基因槍法：常用于單子葉植物； （3）花粉管通道法：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。,25,（2）基因槍法：常用于單子葉植物；,26,花的結(jié)構(gòu)示意圖,1,2,3,4,5,6,7,8,9,花柄,花托,子房,花萼,花瓣,花柱,柱頭,花藥,花絲,雄蕊,雌蕊,（花冠）,（3）花粉管通道法：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。,27,28,2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,顯微注射技術(shù)： 利用微量注射器在顯微鏡下直接把目的基因注入宿主細(xì)胞。,3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,導(dǎo)入大腸桿菌的方法: 首先用Ca2+ 處理細(xì)胞，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)感受態(tài)細(xì)胞。 第二步是將重組表達(dá)載體DNA分

11、子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。,顯微注射技術(shù),提純基因表達(dá)載體,29,采用氯化鈣來改變其通透性是為了制感受態(tài)細(xì)胞，原理是，用低滲CaCl2溶液在低溫（0）時(shí)處理快速生長的細(xì)菌，此時(shí)細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，通過熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收。,蔡信之微生物學(xué)181頁，兩種理論都是假說，1、局部原生質(zhì)化，也就是細(xì)胞壁上出現(xiàn)孔，2、好像還涉及細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)化因子（分子量5000-1-0000）的蛋白質(zhì)的形成和細(xì)胞表面受體結(jié)合的轉(zhuǎn)運(yùn)問題。,劉祖洞得遺傳書下冊(cè)，174頁，用鈣離子處

12、理使細(xì)胞膜上出現(xiàn)漏隙，DNA容易進(jìn)入。,30,目前常用的對(duì)原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法有兩類：電穿孔轉(zhuǎn)化法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法。電穿孔轉(zhuǎn)化法屬于物理方法，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特殊處理，但由于受到儀器的限制，實(shí)驗(yàn)室更常用的是化學(xué)轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化法是利用低溫（0）和氯化鈣（CaCl2）低滲溶液的理化處理使宿主細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)，即感受態(tài)（competence），此時(shí)菌體膨脹成球形，細(xì)胞壁和膜的通透性增強(qiáng)。重組DNA與Ca2+形成的羥基-磷酸鈣復(fù)合物黏附于菌體表面，經(jīng)42短暫的熱沖擊處理（熱休克）后，黏附表面的重組DNA被吸收進(jìn)入宿主細(xì)胞。然后在營養(yǎng)豐富的的培養(yǎng)基上生長1小時(shí)左右，細(xì)胞形態(tài)復(fù)原，進(jìn)入增殖分裂

13、期。,體外重組的DNA分子，需按一定的方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過宿主細(xì)胞的復(fù)制而使目的基因得到大量的擴(kuò)增。宿主細(xì)胞也稱為受體細(xì)胞，分為原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩類。原核細(xì)胞以大腸桿菌為主，真核細(xì)胞包括酵母及動(dòng)物細(xì)胞等。重組分子導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞的過程就是轉(zhuǎn)化。在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化(transformation)特指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（氯化鈣法）及轉(zhuǎn)化,31,細(xì)胞壁厚度因細(xì)菌不同而異，一般為15-30nm。主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸構(gòu)成雙糖單元，以（1-4）糖苷鍵連接成大分子。N-乙酰胞壁酸分子上有四肽側(cè)鏈，相鄰聚糖纖

14、維之間的短肽通過肽橋（革蘭氏陽性菌）或肽鍵（革蘭氏陰性菌）橋接起來，形成了肽聚糖片層，像膠合板一樣，粘合成多層。 肽聚糖中的多糖鏈在各物種中都一樣，而橫向短肽鏈卻有種間差異。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁厚約2080nm，有15-50層肽聚糖片層，每層厚1nm，含20-40的磷壁酸（teichoic acid），有的還具有少量蛋白質(zhì)。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁厚約10nm，僅2-3層肽聚糖，其他成分較為復(fù)雜，由外向內(nèi)依次為脂多糖、細(xì)菌外膜和脂蛋白。此外，外膜與細(xì)胞之間還有間隙。 肽聚糖是革蘭陽性菌細(xì)胞壁的主要成分，凡能破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)或抑制其合成的物質(zhì)，都有抑菌或殺菌作用。如溶菌酶是N-乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制轉(zhuǎn)肽

15、酶的活性，抑制肽橋形成。 細(xì)菌細(xì)胞壁的功能包括：保持細(xì)胞外形；抑制機(jī)械和滲透損傷（革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁能耐受20kg/cm2的壓力）；介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；協(xié)助細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和分裂。 脫壁的細(xì)胞稱為細(xì)菌原生質(zhì)體（bacterial protoplast）或球狀體（spheroplast，因脫壁不完全），脫壁后的細(xì)菌原生質(zhì)體，生存和活動(dòng)能力大大降低。,32,1、檢測與鑒定的目的,目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持 和表達(dá)其遺傳特性。,步驟四：目的基因的檢測與鑒定,2、分子水平的檢測 檢測是否插入了目的基因 檢測是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 檢測是否翻譯成蛋白質(zhì) 3、個(gè)體生物學(xué)水

16、平的檢測 做抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn),抗原-抗體雜交,DNA分子雜交技術(shù),DNA-RNA分子雜交技術(shù),33,34,DNA,附著在膜上,硝化纖維素,加探針,報(bào)告基因（含熒光素分子）,變性,DNA雜交 （如檢測SARS病毒等）,a,b,c,d,35,不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)。,受體細(xì)胞攝入DNA分子后，就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？,若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲基因再進(jìn)行修飾。,36,基因工程的基本操作程序,目的基因的獲取,基因表達(dá)載體的構(gòu)建,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,目的基因的檢測與鑒定,1、從基因文庫中獲取目的基因 2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 3、化學(xué)方法人工合成,復(fù)

17、制原點(diǎn) + 目的基因 + 啟動(dòng)子 + 終止子 + 標(biāo)記基因,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、Ca2+處理法,DNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原抗體雜交技術(shù),分子檢測外的個(gè)體水平鑒定,37,1.以下說法正確的是 （ ） A.所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列 B.質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C.運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D.基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來 2.有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是 （ ） A.DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來 B.限制性核酸內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C.目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D.人

18、工合成目的基因不用限制性核酸內(nèi)切酶,C,練習(xí),A,3.在遺傳工程技術(shù)中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得 A.人的胰島素基因 B.蠶的蠶絲蛋白基因 C.芽孢桿菌的抗蟲基因 D.菜豆儲(chǔ)藏蛋白基因,C,38,D,4.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 （ ） A.能復(fù)制 B.有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C.具有標(biāo)記基因 D.它是環(huán)狀DNA 5.有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A.限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B.重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C.質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料 6.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的

19、步驟是 （ ） A.人工合成目的基因 B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D.目的基因的檢測和表達(dá),D,C,39,40,1.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？,有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,2.-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？,尋根問底：,41,（1）從小鼠中克隆出-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。 （2）將cDN