1、第9講 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物制藥I,先看看人體的一些細(xì)胞,免疫細(xì)胞,白血球,巨噬細(xì)胞,殲滅癌細(xì)胞,細(xì)胞與細(xì)胞,樹突細(xì)胞,骨細(xì)胞,成骨細(xì)胞,膠質(zhì)細(xì)胞,視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞,黑色素細(xì)胞,本節(jié)主要內(nèi)容,1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn) 2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件、方式 3.原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)技術(shù),本節(jié)關(guān)鍵問題,問題1：動(dòng)物細(xì)胞體外生長特點(diǎn) 問題2：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基特點(diǎn) 問題3：動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)方法 問題4：動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法,（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),1 定義：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（Animal cell culture）是模擬體內(nèi)生理環(huán)境使分離的動(dòng)物細(xì)胞在體外生存、增殖的一門技術(shù)。 2 歷史： 1907年,哈里森（Harr

2、ison）采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活了幾周時(shí)間，并觀察到細(xì)胞突起的生長過程，開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河。 法國學(xué)者卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)的卡氏培養(yǎng)瓶1923年用于培養(yǎng)雞胚的心肌組織取得成功，極大推動(dòng)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立。 1951年，厄爾利（Earle）等人開發(fā)了動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。伴隨著培養(yǎng)工具與培養(yǎng)基的不斷完善，動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)日益成熟。,3 應(yīng)用領(lǐng)域,生產(chǎn)藥品：作為宿主細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)原核細(xì)胞所不能生產(chǎn)的藥用蛋白 基礎(chǔ)研究的細(xì)胞材料：細(xì)胞模型 種子細(xì)胞：為組織修復(fù)與器官再生提供種子細(xì)胞,4 特點(diǎn),動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大，無細(xì)胞壁，對(duì)機(jī)

3、械攪拌或剪切力敏感。 動(dòng)物細(xì)胞生長緩慢，易受污染。 正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去。 動(dòng)物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在，大多需要貼附在載體表面才能生長。,體外生長的動(dòng)物細(xì)胞一般具有貼附、細(xì)胞接觸性抑制、密度抑制的特點(diǎn)。 懸浮型細(xì)胞：與微生物、植物細(xì)胞不同，動(dòng)物細(xì)胞中只有極少數(shù)細(xì)胞體外生長不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，稱之為懸浮型細(xì)胞。血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞等屬于此類細(xì)胞。 貼附型細(xì)胞：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞必須附著在帶適量正電荷的固體或半固體表面才能生長。屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：,A 成纖維細(xì)胞型細(xì)胞,外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀相似，細(xì)

4、胞大致呈梭形或不規(guī)則形。成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等形式。多數(shù)細(xì)胞之間排列疏散，有較大的細(xì)胞間隙。,B 上皮型細(xì)胞,類似上皮細(xì)胞的細(xì)胞，特點(diǎn)是：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞。因?yàn)橄嗷頂D而呈現(xiàn)“鋪路石狀”，局部可以單層的上皮狀“膜片組織”。 皮膚的表皮細(xì)胞、消化管與呼吸道的上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、消化腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。,C 游走型細(xì)胞,呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。,D 多形型細(xì)胞,多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞。多形型

5、細(xì)胞不常見，只有某些像神經(jīng)組織細(xì)胞等難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的，才可歸于多形細(xì)胞。體外培養(yǎng)呈現(xiàn)多形型細(xì)胞的細(xì)胞最常見的是神經(jīng)原和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。,接觸性抑制(Contact inhibition) 是某些動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長特性之一。是指由于細(xì)胞相互接觸而抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的現(xiàn)象（圖11.2）。由于這個(gè)特性，正常細(xì)胞并不會(huì)相互重疊，而是呈單層細(xì)胞生長。 密度抑制(Density inhibition) 細(xì)胞接觸匯合成片后，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂。但是當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度后，營養(yǎng)相對(duì)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，發(fā)生密度抑制現(xiàn)象,（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件,嚴(yán)格的無菌技術(shù):細(xì)菌真菌支原體病毒交叉污染 1

6、.培養(yǎng)基 對(duì)于營養(yǎng)要求非?？量蹋被?、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽、輔酶、激素、生長因子等。 包括：天然、合成、無血清培養(yǎng)基三種。,（1）天然培養(yǎng)基,動(dòng)物血清（胎牛血清、小牛血清）、組織提取液、雞胚胎汁等。 優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)價(jià)值高 缺點(diǎn)：成分復(fù)雜、來源有限、成本較高 血清（serum）：纖維蛋白已被除去(如通過血凝或去纖維蛋白法)的血漿。,（2）合成培養(yǎng)基,優(yōu)點(diǎn)：成分已知，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行控制。 缺點(diǎn)：無法替代一些未知成分 解決途徑合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補(bǔ) 目前常用的合成培養(yǎng)基包括：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等.,例如,MEM培養(yǎng)基：厄爾利（Earle）于195

7、1年開發(fā)成功。含有少量氨基酸、維生素、谷氨酰胺以及必須的無機(jī)鹽，組成簡單。 DMEM培養(yǎng)基：由杜爾貝科（Dulbecco）等在MEM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上研制而成，增加了各已有成分的含量，同時(shí)又根據(jù)葡萄糖高低分為高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型適合生長較快、貼附性差的細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞）培養(yǎng)。,（3）無血清培養(yǎng)基,血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：含有豐富的利于細(xì)胞生長的 成分 血清培養(yǎng)基缺點(diǎn)： （1）動(dòng)物血清來源有限，價(jià)格高，不宜大量使用。 （2）動(dòng)物血清成分復(fù)雜且成分不穩(wěn)定，使生長過 程不易檢測控制。 （3）雖然血清對(duì)細(xì)胞生長有效，但會(huì)對(duì)后期培養(yǎng) 產(chǎn)物的分離、提純以及檢測造成一定困

8、難。,無血清培養(yǎng)基,無血清培養(yǎng)基(Serum free medium,SFM)是不含血清的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分組成。試圖全部替代血清成分。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基較常用的是DMEM、F12培養(yǎng)基。 添加組分主要包括：細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子、結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶抑制劑等。,2 其他溶液,（1）平衡鹽溶液（Balanced salt solution，BSS） 主要由無機(jī)鹽組成，具有維持細(xì)胞滲透壓、調(diào)控培養(yǎng)液酸、堿度平衡的功能。 例如：Hanks液 注：酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。,（2）培養(yǎng)基pH調(diào)整液. 大部分合成培養(yǎng)液都呈微酸性。

9、常用pH調(diào)整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。 注：HEPES是一種非離子兩性緩沖液，其在pH 7.2 - 7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力： 化學(xué)名：2-4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylethanesulfonic acid。 中文名：4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸。 分子式：C8H18N2O4S,（3）細(xì)胞消化液,從組織塊消化分散得到單個(gè)細(xì)胞 傳代培養(yǎng)時(shí)分散細(xì)胞 胰蛋白酶溶液：水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，加血清終止反應(yīng) 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）消化液：解離細(xì)胞,兩者常結(jié)合使用，增加效果。,（4）抗生素溶液,防止微生物污染。 常用抗生素有

10、青霉素、鏈霉素、卡那霉素、制霉菌素等。,3 培養(yǎng)條件,影響動(dòng)物細(xì)胞體外生長的因素包括生物因素、化學(xué)因素、物理因素。生長條件的控制主要包括溫度、pH、滲透壓、氣體等。 溫度：人類和哺乳類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜溫度為36.55。 pH：哺乳動(dòng)物細(xì)胞為7.1-7.3。 滲透壓：細(xì)胞在高滲透壓或低滲透壓溶液中會(huì)發(fā)生皺縮或腫脹，甚至破裂。BSS溶液。 氣體：細(xì)胞的生長代謝離不開氣體，主要包括O2和CO2。二氧化碳培養(yǎng)箱。,4 培養(yǎng)工具,新型培養(yǎng)器皿的設(shè)計(jì)成功和一些培養(yǎng)技術(shù)的建立促使動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)日趨成熟。 1923年卡雷爾（Carrel）（法國醫(yī)學(xué)家、生物學(xué)家，1912年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）設(shè)計(jì)了用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

11、的卡式培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)雞胚心肌組織獲得成功。 培養(yǎng)瓶的形狀主要是適合細(xì)胞貼壁生長和顯微鏡觀察的扁平形狀。培養(yǎng)瓶主要有高硼硅玻璃培養(yǎng)瓶與聚苯乙烯塑料培養(yǎng)瓶?？ㄊ脚囵B(yǎng)瓶可以較好地保證無菌的環(huán)境，為細(xì)胞提供生長空間，這為隨后的動(dòng)物細(xì)胞體外大量培養(yǎng)發(fā)揮了重要作用。,CO2培養(yǎng)箱,哺乳動(dòng)物離體細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)細(xì)胞一樣,需要在恒定溫度下才能生存,溫差變化一般不應(yīng)超過0.5度，因此培養(yǎng)箱對(duì)溫度應(yīng)具有較高靈敏度。 CO2培養(yǎng)箱的優(yōu)點(diǎn)在于能恒定地供應(yīng)一定量的CO2,一般5%即可維持培養(yǎng)液PH值穩(wěn)定。,過濾裝置,各種培養(yǎng)用液只能用過濾的方法進(jìn)行除菌消毒處理。微化濾膜濾器是目前應(yīng)用最廣泛的過濾裝置。,同微生物、植物細(xì)胞培

12、養(yǎng)不同，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基與其他溶液不能經(jīng)受高溫滅菌，多采用過濾除菌（例如支原體污染），因此需要特殊的濾器。 支原體（mycoplasma）：又稱霉形體，是一種能夠自我復(fù)制的最小的原核微生物，沒有細(xì)胞壁，許多常見的抗生素（如青霉素）對(duì)支原體是無效的。四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等作用于核蛋白體的抗生素有抑制作用。大小為0.2-0.3m，可通過一般濾菌器，40納米過濾技術(shù)可去除。,水純化裝置細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的質(zhì)量要求較高。一般需要使用重蒸或三蒸水配制各種培養(yǎng)用液。,（三）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)可以分為貼壁培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)三大類。 1 貼壁培養(yǎng)（Adherent culture）是指細(xì)胞貼

13、附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：容易更換培養(yǎng)液；容易采用灌注式培養(yǎng)、不需過濾系統(tǒng)；同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例、適用于所有類型細(xì)胞。 缺點(diǎn)：擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難、投資大；占地面積大；不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長。,（1）貼壁材料,要求：具有親水性、正電荷。 常用材料：硅硼酸玻璃（卡氏培養(yǎng)瓶等）、聚苯乙烯（96孔培養(yǎng)板等） 對(duì)微載體而言還要求具一定三維結(jié)構(gòu)。,（2）貼附生長過程,游離期：接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)。 吸附期：不同類型的細(xì)胞的貼壁時(shí)間有所差異，多數(shù)細(xì)胞都可在24小時(shí)內(nèi)貼壁。 繁殖期：懸浮細(xì)胞貼壁后經(jīng)過一段停滯后開始分裂。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，細(xì)胞間開始接觸并連接成片。出現(xiàn)接觸

14、性抑制。 退化期：細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶壁，隨著營養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，密度抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，細(xì)胞開始退化。如不及時(shí)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞會(huì)從瓶壁上脫落死亡。,細(xì)胞貼壁過程,2 固定化培養(yǎng),可以采用類似植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)的方法對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行固定化培養(yǎng)。 具有細(xì)胞生長密度高、抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易于產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物分離純化。固定化方法與植物細(xì)胞類似。,3 懸浮培養(yǎng),是指細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長。 主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞、血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，某些腫瘤細(xì)胞等屬于此類細(xì)胞。 貼壁型細(xì)胞貼附在微載體上或者包裹在微囊中后可以接種在適當(dāng)生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)。,（四）動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模

15、培養(yǎng),1 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)成功卡氏瓶，可以保證動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境和生長空間。 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法是目前動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)的主要方法之一。,2 培養(yǎng)板培養(yǎng)法（微量培養(yǎng)法）,現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)最為常用的方法之一。 基本要點(diǎn)：將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。常用的培養(yǎng)板有6孔、24孔、96孔培養(yǎng)板。,3 灌注小室培養(yǎng)法,1912年由伯羅設(shè)計(jì)了一種簡單的灌注小室培養(yǎng)模型。 基本要點(diǎn)：將細(xì)胞接種于一個(gè)由上下兩個(gè)蓋玻片（分別構(gòu)成上壁與下壁）與一金屬圈（構(gòu)成側(cè)壁）密封圍成的小室內(nèi)，保持在一定條件下培養(yǎng)。在小室的側(cè)面分別有液體流入和流出的開口，供新鮮培養(yǎng)

16、液流入和舊培養(yǎng)液排出。 顯著特點(diǎn)：營養(yǎng)液可以循環(huán)供應(yīng),4 轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法,1933-1934年，蓋爾（Gey） 和劉易斯（Lewis）建立了旋 轉(zhuǎn)管培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)物接 種于一管狀培養(yǎng)器皿中，再 將其固定在一可以旋轉(zhuǎn)的裝 置上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)方法克服了靜置培養(yǎng)的不足，例如：細(xì)胞生 長環(huán)境不均勻、不利于營養(yǎng) 的吸收等，培養(yǎng)物可以交替 地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境， 利于細(xì)胞或組織生長。,（五）動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng),接種組織塊直接長出單層細(xì)胞或?qū)⒔M織分散成單個(gè)細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)，在首次傳代前的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)（Primary culture）。 一般持續(xù)1-4周。在這個(gè)階段，細(xì)胞有分裂但不旺盛。細(xì)胞多呈二倍體

17、核型。這樣的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞（Primary cell）。 優(yōu)點(diǎn)：組織和細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，在一定程度上能反映體內(nèi)的形態(tài)學(xué)特征。在供體來源充分、生物學(xué)條件穩(wěn)定的情況下，原代細(xì)胞是很好的實(shí)驗(yàn)材料，例如藥物測試、研究細(xì)胞分化等。,1 組織塊原代培養(yǎng),是比較常用的簡易的原代培養(yǎng)方法，也是早期動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法。以培養(yǎng)瓶培養(yǎng)為例： （1）用吸管吸出組織塊一一放入培養(yǎng)瓶內(nèi)，一般每小塊間隔為0.2-0.5厘米，使其均勻貼在培養(yǎng)瓶的壁上。 （2）然后將貼有組織塊的瓶壁朝上，加入培養(yǎng)液，塞上瓶塞，傾斜置于37的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-4小時(shí)后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)。24小時(shí)后再補(bǔ)充培

18、養(yǎng)液，一般3-5天更換培養(yǎng)液。 （3）一般情況下，組織塊貼壁后24小時(shí)細(xì)胞就從組織塊四周長出，5-7天組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落，組織塊四周的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片。,2 細(xì)胞原代培養(yǎng),酶解制備單細(xì)胞 根據(jù)不同的組織對(duì)象采用適當(dāng)?shù)拿赶韩@得動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。胚胎等組織細(xì)胞潛伏期短，第二天既可見生長，一周便可接連成片；成體組織來源的細(xì)胞潛伏期長，一般要一周左右。 最常用的有胰蛋白酶和膠原酶，鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于動(dòng)物細(xì)胞的消化。 EDTA適合消化傳代細(xì)胞，常與胰蛋白酶一起使用 ,原代培養(yǎng)示意圖,（六）動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)（Passage culture/Subcul

19、turing）是指將原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程。細(xì)胞的體外大量增殖以及細(xì)胞系的建立是通過傳代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)的。 注意：每進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱為傳一代。這里的傳代代數(shù)與細(xì)胞代數(shù)或倍增不同，“一代”是指從細(xì)胞接種培養(yǎng)到分離再培養(yǎng)期間的一段時(shí)間。在細(xì)胞一代中，細(xì)胞約能倍增36次。,1 傳代培養(yǎng)方法,懸浮生長的細(xì)胞可以采用加入新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散傳代，或者采用自然沉降法加入新鮮培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代。 對(duì)于貼壁生長的動(dòng)物細(xì)胞，原代培養(yǎng)細(xì)胞分裂增殖擴(kuò)展成片后需要進(jìn)行細(xì)胞分離重新接種培養(yǎng)。 一般采用酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。,酶消化的傳代方法, 吸出或者倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液。 加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。 2-5分鐘后檢查，有細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞質(zhì)回縮現(xiàn)象時(shí)添加培養(yǎng)液終止消化。 吸出消化液，加入Hanks液輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，洗去殘留消化液。 加入培養(yǎng)液