1、大學(xué)畢業(yè)(設(shè)計(jì))論文第23頁(yè)編號(hào)：本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)題目：鉛離子和牛血清白蛋白相互作用的光譜分析Pb2與牛血清白蛋白相互作用的光譜研究學(xué)院學(xué)院專業(yè)化產(chǎn)業(yè)班級(jí)級(jí)別學(xué)習(xí)編號(hào)姓教師職稱完工日期牛血清白蛋白與鉛離子相互作用的光譜分析本文利用熒光光譜、紫外光譜和紅外光譜分析了鉛離子與牛血清白蛋白相互作用的光譜特征。探討了酸堿度、牛血清白蛋白濃度、鉛離子濃度和離子強(qiáng)度等不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)鉛離子-牛血清白蛋白體系光譜的影響及最佳實(shí)驗(yàn)條件。鉛離子與牛血清白蛋白的相互作用是通過(guò)紫外光譜峰值的變化或移動(dòng)來(lái)初步判斷的。熒光光譜測(cè)定表明，鉛離子能引起牛血清白蛋白的熒光猝滅。用紅外光譜分析了鉛離子對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

2、發(fā)現(xiàn)-轉(zhuǎn)角增加，-螺旋減少，-片層增加。關(guān)鍵詞：鉛離子；牛血清蛋白；熒光光譜；紫外可見光譜；紅外線譜本文用熒光、紫外光譜和紅外光譜研究了Pb2與牛血清白蛋白的相互作用。探討了不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)3360酸堿度、牛血清白蛋白濃度、鉛離子濃度的影響。紫外光譜顯示Pb2與牛血清白蛋白形成化合物。結(jié)果表明Pb2引起牛血清白蛋白的熒光猝滅。紅外光譜表明Pb2與牛血清白蛋白的相互作用會(huì)導(dǎo)致牛血清白蛋白構(gòu)象的改變。因此牛血清白蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)減少，-折疊增加。關(guān)鍵詞：鉛離子；牛血清白蛋白；熒光光譜法；紫外光譜；紅外線分光鏡目錄1.介紹.41.1紫外光譜.51.2熒光光譜.51.3紅外光譜.82.實(shí)驗(yàn)部分.102.1

3、實(shí)驗(yàn)試劑和儀器.102.1.1實(shí)驗(yàn)試劑.102.1.2實(shí)驗(yàn)儀器.102.2實(shí)驗(yàn)試劑的制備.102.2.1緩沖溶液的制備.102.2.2牛血清白蛋白溶液的制備.102.2.3鉛離子溶液的制備.103.結(jié)果和討論.133.1紫外光譜.133.1.1不同酸堿度條件下系統(tǒng)的紫外光譜圖.133.1.2系統(tǒng)在不同牛血清白蛋白濃度下的紫外光譜143.1.3不同硝酸鉛濃度下的紫外光譜圖.133.1.4離子強(qiáng)度對(duì)系統(tǒng)紫外光譜的影響.153.2熒光光譜圖.163.3紅外光譜圖.173.3.1鉛離子存在的紅外光譜圖.193.3.2系統(tǒng)的紅外二階導(dǎo)數(shù)圖.194.結(jié)論.21參考.21謝謝你.221.介紹在生物體中，蛋白

4、質(zhì)是一種極其重要的生物物質(zhì)，在生命的運(yùn)動(dòng)和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)組成、構(gòu)象及其與小分子相互作用機(jī)制的研究是化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、生命科學(xué)、藥學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家和技術(shù)人員共同關(guān)心和感興趣的課題1。血清白蛋白是血漿中最豐富的載體蛋白。它能與許多內(nèi)源性物質(zhì)和外源性藥物有效結(jié)合，形成結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜的復(fù)合物，直接或間接發(fā)揮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)2-4的作用，影響蛋白質(zhì)的生理功能。因此，小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用的研究受到了極大的關(guān)注。蛋白質(zhì)的種類很多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾百萬(wàn)種蛋白質(zhì)。然而，各種蛋白質(zhì)都是含有多個(gè)配位原子的大分子多齒配體(如氮、氧、硫，有些蛋白質(zhì)還含有磷等)。)，因此它們可以容易地與金屬離子

5、或它們的小分子絡(luò)合物相互作用，并對(duì)應(yīng)于不同的光譜特性。蛋白質(zhì)的功能與其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象密切相關(guān)。什么樣的結(jié)構(gòu)有什么樣的功能，反之亦然。蛋白質(zhì)某種生物功能的激活或維持往往與某些生命元素或有益元素的作用密切相關(guān)；同時(shí)，蛋白質(zhì)的某些生物功能或活性的衰退或消失往往受到一些被污染或有害的元素的影響，其中大部分是金屬元素，它們通過(guò)與相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用來(lái)穩(wěn)定或改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，從而達(dá)到控制或影響蛋白質(zhì)功能的目的。因此，可以說(shuō)，研究金屬元素與蛋白質(zhì)的相互作用，特別是不同金屬元素與蛋白質(zhì)在近生理環(huán)境中的相互作用，以及相互作用前后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化，闡明某些金屬元素的作用機(jī)理，對(duì)于從分子水平研究微量元素對(duì)人體

6、健康的影響，預(yù)防中毒和控制環(huán)境污染具有重要意義。牛血清蛋白(BSA)是一種常用的研究蛋白，因?yàn)樗茄獫{中最豐富的載體蛋白，可以與體內(nèi)許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)相互作用，并且這種蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被X射線所確定5-6。牛血清蛋白和人血清蛋白非常相似，它們的氨基酸序列也非常相似。牛血清蛋白是一種具有多個(gè)配位基團(tuán)的生物有機(jī)大分子，能夠與金屬離子配位，因此，牛血清白蛋白的分析具有非常重要的理論和實(shí)際意義。金屬離子與蛋白質(zhì)的相互作用不僅受蛋白質(zhì)自身剛性和柔性結(jié)構(gòu)的影響，還受金屬離子電荷、半徑和配位構(gòu)型等因素的影響。例如，鋅經(jīng)常通過(guò)配位鍵與錫和錫形成四面體結(jié)構(gòu)。此外，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、離子濃度(強(qiáng)度)、酸度、緩

7、沖溶液等。所有這些都會(huì)影響蛋白質(zhì)和金屬離子之間的相互作用。特別值得注意的是離子濃度對(duì)反應(yīng)的影響，濃度過(guò)高或過(guò)低都不會(huì)達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，因?yàn)橛幸婧陀泻υ卦隗w內(nèi)都有一個(gè)相當(dāng)恒定的濃度范圍，任何元素濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不良影響，而蛋白質(zhì)本身仍有鹽析作用，所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)選擇合適的離子濃度范圍。鉛在自然界中廣泛分布，幾乎所有的礦物都含有鉛。鉛離子在生活中很常見。鉛是工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究不可缺少的物質(zhì)之一，在人類生產(chǎn)和生活中發(fā)揮著重要作用。然而，鉛是對(duì)人類和高等生物最有害的有毒元素之一，鉛污染給人類帶來(lái)了多種災(zāi)難。鉛在自然界中以多種形式存在。不同形式的鉛有不同的毒性。研究表明，無(wú)機(jī)鉛可通過(guò)生

8、物甲基化和乙基化產(chǎn)生相應(yīng)的有機(jī)鉛，而有機(jī)鉛可被動(dòng)植物吸收并通過(guò)食物鏈富集，最終危害人類健康。鉛能造福人類，并造成環(huán)境污染。因此，尋找一種高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。早在20世紀(jì)50年代，人們就開始研究蛋白質(zhì)和金屬離子之間的相互作用。自20世紀(jì)60年代以來(lái)，許多科學(xué)家通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)分析和配位化學(xué)的方法研究了一些金屬蛋白和金屬酶的結(jié)構(gòu)，并通過(guò)對(duì)生物活性的研究推測(cè)了它們的作用機(jī)理，這些共同構(gòu)成了生物無(wú)機(jī)化學(xué)的主要研究方向。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，各種檢測(cè)技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展為人們研究蛋白質(zhì)和金屬離子之間的相互作用開辟了新的局面。在這方面，中國(guó)生物無(wú)機(jī)化學(xué)家王魁和

9、沈做了大量的研究工作，許多相關(guān)專著都介紹了具體的實(shí)驗(yàn)。常用的檢測(cè)方法如下：1.1 .紫外線光譜學(xué)紫外吸收光譜分析是了解溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的常規(guī)方法。牛血清蛋白分子在約280納米處有一個(gè)強(qiáng)吸收峰。由于蛋白質(zhì)的不同區(qū)域具有特異性結(jié)合，這將導(dǎo)致上述特征吸收峰在與藥物結(jié)合后發(fā)生偏移，因此在牛血清白蛋白溶液中加入少量復(fù)合物，觀察牛血清白蛋白的特征吸收峰是否發(fā)生偏移或變化，就可以大致知道該復(fù)合物是否與牛血清白蛋白發(fā)生了作用。血清蛋白能吸收紫外光，當(dāng)它與小分子物質(zhì)相互作用時(shí)，會(huì)相應(yīng)地改變吸收峰的位移或譜峰的寬度。杜娜娜等人研究了異煙肼(INH)與牛血清白蛋白的相互作用，并討論了INH對(duì)牛血清白蛋白的熒光猝

10、滅機(jī)理7。呂桂英等人利用紫外-可見分子吸收光譜法研究了吐溫20存在下牛血清白蛋白與鎘試劑1B的相互作用，建立了蛋白質(zhì)檢測(cè)的分析方法，并將其應(yīng)用于牛血清白蛋白產(chǎn)品的檢測(cè)8。張紅梅等人利用紫外光譜研究了不同酸堿度下微乳液體系中稀土Nd3離子與牛血清白蛋白的相互作用，并初步探討了微乳液體系中Nd3離子與牛血清白蛋白相互作用的機(jī)理9。1.2熒光分光光度法熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性好、用量少的優(yōu)點(diǎn)。關(guān)于用熒光光譜法測(cè)定藥物、稀土金屬和牛血清白蛋白的作用的報(bào)道很多10-15。羅紅斌等用熒光光譜法研究了巖白菜素與牛血清白蛋白的相互作用。結(jié)果表明，巖白菜素與牛血清白蛋白反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)為2.083104，結(jié)

11、合位點(diǎn)數(shù)為1 16。李丹等人利用熒光和紫外吸收光譜研究了脫水山梨糖醇與牛血清白蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)在不同溫度下反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)分別為7.410-5(25)和1.710-4 (37)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1 17。吳柯崗等在模擬人體生理環(huán)境下，用熒光分光光度法和紫外-可見分光光度法研究了解熱鎮(zhèn)痛藥對(duì)乙酰氨基酚(PTL)與牛血清白蛋白的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，的熒光由于非輻射能量轉(zhuǎn)移而被淬滅，牛血清白蛋白的熒光強(qiáng)度由于PTL和PTL的結(jié)合反應(yīng)而明顯降低。根據(jù)Stern- Volmer方程和Linewaver-Burk方程，結(jié)合反應(yīng)的靜態(tài)平衡常數(shù)(KLB)為2.592103摩爾-1(297克)，結(jié)合位置距21

12、2位色氨酸1.94納米。根據(jù)結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)，推測(cè)PTL和牛血清白蛋白之間的結(jié)合力是硫-水作用力1。熒光光譜研究的內(nèi)容和方法如下：(1)結(jié)合位點(diǎn)的確定血清白蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到證實(shí)。有三個(gè)相似的域名18:Sitel、Sitell和Site1H。每個(gè)域包含一個(gè)和兩個(gè)子域，這兩個(gè)子域形成了一個(gè)帶有相反缺口的圓柱形結(jié)構(gòu)。大多數(shù)藥物與血清白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)是Sitel和Sitdl。以下方法常用于熒光法測(cè)定藥物分子與血清白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。(2)替換為具有已知特定部分的探針4-7一些熒光探針對(duì)蛋白質(zhì)的不同區(qū)域具有特異性結(jié)合，藥物結(jié)合位點(diǎn)可以根據(jù)藥物對(duì)熒光探針的影響來(lái)確定。Sitel的已知探針包括3

13、3，360華法林、苯丁酮、丹西酰胺等。Site11的探針包括：布洛芬、氟芬那酸等。(3)藥物和色氨酸殘基之間的距離由福斯特能量轉(zhuǎn)移理論計(jì)算19-22蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要由色氨酸產(chǎn)生。利用福斯特的能量轉(zhuǎn)移理論，可以計(jì)算出藥物與蛋白質(zhì)和色氨酸殘基相互作用的距離，并推斷出藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的空間位置。能量轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在藥物-蛋白質(zhì)復(fù)合物中或藥物和蛋白質(zhì)分子之間。在后一種情況下，獲得的藥物和色氨酸殘基之間的距離表示分子擴(kuò)散過(guò)程中藥物分子和色氨酸殘基之間的最近距離22。(4)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目和結(jié)合常數(shù)的測(cè)定Scatchard作圖法是研究生物大分子與有機(jī)小分子結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典方法。當(dāng)應(yīng)用這種方法時(shí)，需要知道反應(yīng)體系中游離藥物的濃度，這通常很難用熒光法測(cè)定，而用斯卡查德作圖法得到的結(jié)果往往不理想；因此，斯卡查德圖譜很少用于研究藥物分子和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合反應(yīng)。張