1、PCR測定中常見問題分析,衛(wèi)生部臨床檢驗中心 王露楠,核酸檢測過程,2,分析后,采集容器 采集方式 保存運輸 不合格樣本： 脂血、溶血、樣本量不足,樣本,分析中,分析前,設備狀態(tài),儀器： 日維護 開機自檢,準備 試劑配制,核酸擴增,結果分析 結果記錄,核酸純化,檢測系統(tǒng),試劑 設備 質控品,人員操作,核酸檢測,結果不準確,問題出在哪？,試劑耗材的質檢 標本的采集與儲存 儀器設備清潔維護（儀器設備狀態(tài)） 人員操作-試劑準備 人員操作-樣本的制備-核酸純化 人員操作-加樣 設備狀態(tài)-擴增、檢測 結果分析 報告解釋,污染控制,標本的采集與儲存,1. 采集的容器 例如：血液樣本，采血管規(guī)格，抗凝劑種類

2、？ 容器到達實驗室時應處于未曾開啟狀態(tài) 2樣本的保存 檢測前、檢測后 保存容器？ 純化后DNA的保存 避免反復凍融,儀器設備狀態(tài),1. 儀器設備校準 加樣器 方式：計量部門、廠家、自校準 擴增儀 方式：廠家 溫浴設備、溫濕度計 2. 設備狀態(tài) 清潔維護,試劑的配制,保證反應的均一性，每次試驗的擴增反應混和 液應一次配出，并至少多配1人份。 配制時注意：試劑充分復融、混勻，開蓋前瞬時離心； 配制后充分混勻，但不可劇烈震蕩，分裝前瞬時離心。 配制后不宜放置過久，因為PCR/RT-PCR反應液中的酶、引物、底物在低溫與室溫下均可按較低的效率起反應而消耗部分原料產(chǎn)生非特異的引物二聚體等，造成擴增效率降

3、低，一般的建議是配制完PCR反應液后的0.53小時內(nèi)應及時上機擴增，加模板后應盡快上機,試劑準備、加樣,試劑配制的均一性、分裝的均一性 常用試劑的分裝、儲存及使用容器 加樣準確性和重復性 加樣量,樣本的制備-核酸純化,核酸提取方法 人員操作 儀器設備狀態(tài) 樣本量,樣本的制備-核酸純化,一般原理：均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結合于核酸的蛋白質，從而將靶核酸從細胞內(nèi)釋放出來。 一般步驟：去垢劑裂解-蛋白酶處理- 有機溶劑提取-乙醇沉淀等步驟。 純化目的：核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴增的物質去除。,1. 核酸提取方法,樣本的制備-

4、核酸純化,純化質量評價： 抑制物的去除 來自樣本-血紅素及其代謝產(chǎn)物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。 來自提取過程-乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機溶劑 。 保證措施：對臨床標本中可能存在的抑制/干擾物的質控措施；核酸提取及擴增有效性的質控,樣本的制備-核酸純化,2. 人員操作 加樣的準確 避免交叉污染 振蕩的幅度、時間 溫育的溫度、時間 ,樣本的制備-核酸純化,3. 儀器設備狀態(tài) 離心機 金屬浴/水浴 加樣器 全自動樣本處理系統(tǒng),樣本的制備-核酸純化,1純化的原則 防止和抑制DN

5、ase對DNA的降解； 盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞，保持DNA分子的完整； 將蛋白質、脂類、糖類等物質分離干凈。 2可能出現(xiàn)的問題 模板中含有雜蛋白質，特別是染色體中的組蛋白 模板中含有Taq酶抑制劑； 在提取制備模板時丟失過多，提取效率低 提出過程中引入的有機溶劑未去除。,?,樣本的制備-核酸純化,4.樣本量 50l 樣本 靈敏度500IU/ml 200l 樣本 靈敏度50IU/ml,?,擴增、檢測,1加模板（上樣） 加入提取好的核酸模板時需格外小心，往往PCR擴增所需加入的模板量只有2l，加樣器的使用顯得尤其重要，須控制加樣精密度于準確的。 擴增管蓋子要蓋緊，管蓋沒有蓋好造成PC

6、R反應液熱蒸發(fā)，影響反應溫度的準確控制及反應也各成份的濃度，同時也成為一個污染源。（壓蓋時由于粗心或者用力不均致使部分蓋子變形，也是實驗室常見的問題）,擴增、檢測,熟悉儀器設備的特點，標本的放置，參數(shù)設置 擴增、檢測 影響因素：引物、探針、儀器設備狀態(tài) 擴增效率：,關于污染,1樣本的污染 微生物、操作人員、標本之間的交叉污染 2擴增產(chǎn)物或模板的污染 試劑、加樣器、操作臺面 PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml) ，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。 氣溶膠：空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形

7、成氣溶膠而污染，據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝。,關于污染,1樣本的污染 微生物、操作人員、標本之間的交叉污染 2擴增產(chǎn)物或模板的污染 試劑、加樣器、操作臺面 PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml) ，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。 氣溶膠：空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染，據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝。,關于污染,3. 污染的監(jiān)測-陰性對照 每次PCR實驗務必做陰性對照，它包括： 陰性標本對照 空白試劑對照,關于污染,4防止污染的方法 實驗室合理分區(qū)

8、制定工作流程并嚴格執(zhí)行 實驗室的清潔 使用哪種消毒（去污染）劑？ 設備、加樣器、工作臺面.選擇鹽酸還是次氯酸？ 去污染效果取決于有效氯的濃度：0.05 0.5%,關于污染,5何時、怎樣去污染？ 噴灑10% bleach 15-30min 清水擦 每次PCR后和泄漏時進行,關于污染,含氯消毒液的稀釋和貯存： 用潔凈的水稀釋消毒液，自來水雖然方便，但是次氯酸不穩(wěn)定，尤其是在水質較硬的情況下； 盡量新鮮配置，1：10稀釋的消毒液，1-2周穩(wěn)定； 稀釋的含氯消毒液放在室溫不透明的容器里；將稀釋的次氯酸消毒液放在常規(guī)使用的噴霧瓶中，放在水槽下。溫度、光照和氧化作用都可以使之分解變質。,關于污染,紫外燈的

9、使用 紫外波長（nm）一般選擇254/300nm 照射30min 即可 有效距離：60-90cm 需要注意的是，選擇UV 作為消除殘留PCR 產(chǎn)物污染時，要考慮PCR 產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV 照射僅對500bp 以上長片段有效，對短片段效果不大。,其他細節(jié)問題,加樣器 吸樣器污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。,其他細節(jié)問題,預混和分裝PCR試劑 PCR試劑都應小量分裝，避免污染機會。PCR反應液應與陽性對照、樣品及PCR產(chǎn)物