1、基因工程的基本操作程序,1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄,不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段,：能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列.包括啟動(dòng)子和終 止子,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動(dòng)子,終止子,2、真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),與RNA聚

2、合酶 結(jié)合位點(diǎn),內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內(nèi)含子：,外顯子：,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（啟動(dòng)子）。,非編碼序列 =,非編碼區(qū) + 內(nèi)含子,3、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,思考,編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,信使RNA的加工：,成熟的信使RNA,轉(zhuǎn)錄,加工,初級(jí)轉(zhuǎn)錄物,剪切內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄部分

3、拼接外顯子轉(zhuǎn)錄部分,真核生物基因轉(zhuǎn)錄后的剪切、拼接和轉(zhuǎn)移等過程，都需要有調(diào)控序列的調(diào)控，這是真核生物所特有的。,編碼區(qū),基因表達(dá)的計(jì)算,在真核生物中，對(duì)應(yīng)的是 的堿基數(shù),631,氨基酸數(shù),堿基數(shù),？,補(bǔ)充資料,基因中外顯子,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四個(gè)步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,一、目的基因的獲取,1）、從基因文庫(kù)中獲?。哼m用目的序列未知情況,2）、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增：適用于目的基因核酸序列已知,3）、人工合成：適用目的基因不是很大且序列已知的,1、目的基因：是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因，它是

4、編碼某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。 獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步 。,2、獲取目的基因的常用方法,（一）、從基因文庫(kù)中獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù),1、基因文庫(kù),基因組文庫(kù)的構(gòu)建,2、基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,通過對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因, cDNA文庫(kù)的構(gòu)建-反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA,單鏈DNA,逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,雙鏈DNA (目的基因),基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較,小

5、,大,無,有,無,有,某種生物的部分基因,某種生物的全部基因,可以,部分基因可以,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。 如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性,從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法,（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,1、PCR的含義多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫 是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。,2、原理： 3、前提： 4、原料 5、方式,PCR擴(kuò)增儀,DNA雙鏈復(fù)制,一段已知目的基因的核苷酸序列，以合成引物,以_方式擴(kuò)增， 即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,模板DNA；DNA引

6、物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子,6、過程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，解旋形成_,b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成與模板互補(bǔ)的_,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,變性、退火、延伸三步曲,（三）、人工合成法：,基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成,7、結(jié)果：,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增,2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,（1） 鳥槍法 （2） 反轉(zhuǎn)錄法 （3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法,人工合成法,（真核生物

7、）,多用于原核生物,直接分離法,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心,1、目的：,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,2、基因表達(dá)載體的組成：,復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因,它們各自的作用是什么?,啟動(dòng)子：是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來,載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)

8、 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,注意,（1）用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出_。 （2）用_ 切斷目的基因，使其產(chǎn)生_。,（3將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個(gè)重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA連接酶,4、過程:,質(zhì)粒,DNA分子,限制酶處理,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,兩個(gè)切口 獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組

9、質(zhì)粒）,同一種,常用的受體細(xì)胞：,有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（主要）,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,Ca2+處理法,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,（1）受體細(xì)胞：體細(xì)胞或受精卵,（2）方法：,(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點(diǎn):,能感染雙子葉植物和祼子植物,對(duì)單子葉植物無感染能力,Ti質(zhì)粒

10、的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體的DNA上,轉(zhuǎn)化過程:,Ti質(zhì)粒 目的基因,構(gòu)建,表達(dá)載體,植物細(xì)胞,植物細(xì)胞染色DNA,新性狀,農(nóng)桿菌,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。,（2）基因槍法,適用于單子葉植物,（3）花粉通道法,植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。,適用于被子植物,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,受體細(xì)胞：,受精卵（全能性高）

11、,方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）,程序：,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞, 常用法：Ca2+處理, 常用菌：大腸桿菌, 微生物作受體細(xì)胞原因： 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少, 過程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,（用Ca2處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性）,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢查是否成功,（一）、檢測(cè),1、導(dǎo)入檢測(cè)：利用標(biāo)記基因的特性,2、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA .用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針 .使探針和轉(zhuǎn)基因

12、生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過程:,（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）,3、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,4、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,DNA分子雜交,方法:,抗原抗體雜交,過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測(cè),導(dǎo)入檢測(cè)：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,方法,利用標(biāo)記基因的特性,表達(dá)檢測(cè),轉(zhuǎn)錄檢測(cè)DNA分子雜交,翻譯檢測(cè)抗原抗體雜交,分子檢測(cè)法,鑒定,抗蟲鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等,個(gè)體水平的鑒定,插入檢測(cè)：目的基因是否插入受

13、體細(xì)胞DNA上,方法：DNA分子雜交,思考與探究：,2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個(gè)抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?,要選擇合適的農(nóng)桿菌 要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì) 加入酚類物質(zhì),3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？,糖蛋白是蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,4.-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？,（1）從小鼠中克隆出-珠蛋白