1、第三章 免疫學檢測技術(shù),韶關(guān)學院生科院 易道生,內(nèi)容,掌握抗原抗體反應(yīng)的原理與特點，了解抗原抗體結(jié)合力和比例。 掌握免疫組化（IHC）的原理和方法，熟悉一抗、二抗的選擇與使用。 掌握酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）反應(yīng)的原理方法。 掌握免疫印痕（Western blot）的技術(shù)原理與方法。 了界放射免疫檢測技術(shù)（RIA）的原理與方法。 目標： 掌握ELISA、IHC、 Western blot的操作方法,免疫學檢測技術(shù)就是利用抗原和抗體高度特異性結(jié)合的原理和方法，檢測分析各樣品中的目標物質(zhì)，以監(jiān)控物品質(zhì)量、檢測機體免疫機能和診斷某些疾病的體外檢測方法。 免疫檢測是微量檢測方法，靈敏、特異。隨著方法和

2、技術(shù)的改進，免疫檢測方法已滲入工、農(nóng)、食品、醫(yī)藥等各個領(lǐng)域。,從20世紀50年代美國學者Berson和Yallow發(fā)明了放射免疫測定技術(shù)檢測胰島素起，免疫學檢測技術(shù)經(jīng)歷了從定性到定量；從常量分析到微量、超微量分析；從手工檢測到全自動化；從單個標本檢測到高通量檢測等一系列長足的進步。 本章主要學習血清學檢測方法抗原抗體檢測方法。,免疫學技術(shù)的發(fā)展史,第一節(jié) 免疫學檢測的基本原理,抗原抗體反應(yīng)指抗原與相應(yīng)抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng)。曾叫血清學反應(yīng)。,抗體結(jié)構(gòu),一、抗原抗體的特異性結(jié)合,抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，在體內(nèi)可介導溶細胞效應(yīng)、溶菌、中和病毒、促吞噬作用，形成一整套機體體液免疫功能。 體外反應(yīng)有凝集作

3、用、沉淀作用、調(diào)節(jié)作用、中和作用等。 1、抗原抗體的互補性和親和性 抗原抗體的結(jié)合是基于抗原決定簇（表位）與抗體超變區(qū)分子間的互補性和親和性。,互補性指抗原表位的空間結(jié)構(gòu)與抗體分子超變區(qū)內(nèi)的抗原結(jié)合位點間的空間結(jié)構(gòu)互補嵌合。 親和性指抗體分子上的抗原結(jié)合位點與相應(yīng)抗原表位間互相適應(yīng)產(chǎn)生的吸引力。 互補性是Ag和Ab結(jié)合的基礎(chǔ)，親和性是Ag和Ab 間固有的作用力。 2、抗原抗體結(jié)合力 抗原和抗體分子的結(jié)合可以是游離形式的，也可以結(jié)合在細胞表面。這種結(jié)合也是非共價鍵結(jié)合。,抗原與抗體相互結(jié)合只局限于分子表面的特定部位，即抗原決定簇和抗體結(jié)合位點之間，且以親和力的作用方式結(jié)合在一起。由這些特定部位之

4、間的短程分子力相互作用的結(jié)果。這些吸引力只有在極短的距離內(nèi)才有效。因此抗原決定簇與抗體結(jié)合位點在空間上必須處于緊密接觸狀態(tài)，才能產(chǎn)生足夠的結(jié)合力。這種分子間的互補結(jié)構(gòu)決定了抗原抗體結(jié)合的專一性。 抗原抗體間的作用力有：,抗原抗體分子間的作用力，即親和力包括以下幾種： 1、鹽鍵（離子鍵） 2、范德華力 3、疏水作用 4、氫鍵,3、親水膠轉(zhuǎn)化為疏水膠 抗體和大部分抗原在溶液中是親水膠，不會聚沉。一旦破壞電荷和水化層，如Ag + Ab，減少電荷，由親水膠轉(zhuǎn)化為疏水膠，形成可見的Ag Ab復合物沉淀。 利用此沉淀反應(yīng)可檢測相應(yīng)的抗原或抗體。,二、抗原抗體反應(yīng)的特點,1、特異性 抗原與抗體相互結(jié)合必須有

5、空間構(gòu)型的互補性，因此，有很強的特異性。 但，如果兩種抗原存在相同（似）的表位，或抗原、抗體間構(gòu)型有部分或全部相同，就可能出現(xiàn)交叉結(jié)合凝集或沉淀。 既可能干擾實驗，也可以用于擴大應(yīng)用范圍。,2、比例性 抗原（多價）抗體（2價或以上）不等價性，使抗原抗體反應(yīng)時存在比例關(guān)系，生成物的量與反應(yīng)物的量（濃度）有關(guān)。 比例性：抗原抗體結(jié)合生成復合物的量與反應(yīng)物濃度的關(guān)系。 只有2者分子比例合適，結(jié)合價相互飽和，才生成可見的復合物。 在等價帶區(qū)的溶液中幾乎不存在游歷的抗原和抗體。 滴度（效價）指抗原或抗體與一定量的對應(yīng)物產(chǎn)生明顯可見的反應(yīng)所需的最小量。,抗原抗體反應(yīng)的等價帶（zone of equival

6、ence）：曲線的高峰部分，抗原抗體分子比例合適的范圍。在此范圍內(nèi)，抗原抗體充分結(jié)合，沉淀物形成快而多。 最適比（optimal ratio）：其中有一管反應(yīng)最快，沉淀物形成最多，上清液中幾乎無游離抗原或抗體存在，表明抗原與抗體濃度的比例最為合適。 帶現(xiàn)象（zone phenomenon）：等價帶前后分別為抗體或抗原過剩則無沉淀物形成。 前帶（prezone）：抗體過量 后帶（postzone）：抗原過剩。,抗原抗體比例對反應(yīng)現(xiàn)象的影響,3、可逆性 抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)是一個可逆的反應(yīng)。 Ag + Ab Ag-Ab 高親和力抗原表位和抗體超變區(qū)的構(gòu)型非常適合，結(jié)合牢固，不易解離。解離取決于： 抗

7、體對相應(yīng)抗原的親和力 環(huán)境因素對復合物的影響 當抗體與抗原結(jié)合時，如果是顆?？乖?，則出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；如果是可溶性抗原，則產(chǎn)生沉淀作用。,4、階段性 抗原抗體反應(yīng)被人為分為2階段。 結(jié)合階段： 當抗原與同型抗體相遇時，在合適條件下，不論彼此量的多少，都立即發(fā)生特異性的結(jié)合形成抗原抗體復合物，這一過程通常只需要幾秒的時間便可完成，稱為反應(yīng)的一級階段。 反應(yīng)階段：在一級階段之后，繼發(fā)出現(xiàn)抗原與抗體間進一步交聯(lián)而形成網(wǎng)絡(luò)狀凝集物，進而出現(xiàn)可見的凝集和沉淀，稱為反應(yīng)的二級階段。這一階段是抗原抗體網(wǎng)格生長的階段，速率要慢的多，且在很大程度上依賴于溫度、離子強度等外界條件，但更重要的是需要合適的抗原抗體分子比

8、例。只有當二者的結(jié)合價彼此飽和時，才能連接成一個大網(wǎng)格樣凝集物，出現(xiàn)凝集或沉淀。,三、影響抗原抗體反應(yīng)的因素,抗原抗體自身因素 抗原：理化性狀 決定簇種類和數(shù)量 抗體： 來源： 兔等， 馬、人 單克隆抗體 濃度 特異性和親和力,2 環(huán)境因素 電解質(zhì) Na+和C1，可分別中和膠體粒子上的電荷，使膠體粒子的電勢下降，促使抗原抗體復合物從溶液中析出，形成可見的沉淀物或凝集物。 酸堿度 抗原抗體反應(yīng)一般在pH為68進行。PH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)，例如pH達到或接近抗原的等電點時，即使無相應(yīng)抗體存在，也會引起顆粒性抗原非特異性的凝集，造成假陽性反應(yīng)。,溫度 溫度升高可加速分子運動，抗原

9、與抗體碰撞機會增多，使反應(yīng)加速。但若溫度高于56時，可導致已結(jié)合的抗原抗體再解離，甚至變性或破壞；在40時，結(jié)合速度慢，但結(jié)合牢固，更易于觀察。常用的抗原抗體反應(yīng)溫度為37。 適當振蕩/攪拌 可促進抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng),特異性,結(jié)合力的表示方法,親和力和親合力,Ag-Ab反應(yīng)的原理,Ag-Ab反應(yīng)的可見性,常見血清學檢測 1.凝集反應(yīng),直接凝集反應(yīng),1:2稀釋待測血清 1:4 1:8 1:16,細菌、細胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)Ab在電解質(zhì)存在的情況下結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。,玻片法,試管法,常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定,常用于檢測抗體的滴度或效價，見于臨

10、床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達氏反應(yīng)和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗。,間接凝集反應(yīng),將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)Ab/Ag進行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫間接凝集反應(yīng)。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O”試驗、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風濕因子檢測。 凝集反應(yīng)常用于溶血性疾病的診斷：,+,病人的RBC,體內(nèi)anti-Rh,由于抗體多屬于IgG，分子量較小，抗體與紅細胞間的結(jié)合力不能克服細胞間的排斥力，不出現(xiàn)凝集,+,Y,體外加入抗人IgG,出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫直接庫姆試驗,正常人O型血的Rh+的RBC,+,患者血清內(nèi)的游離anti-Rh,+,Y,體外加入抗人I

11、gG,出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫間接庫姆試驗,2.沉淀反應(yīng),單向免疫擴散,雙向免疫擴散,免疫比濁,過量Ab Ab Ab Ab,毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進行，也可在半固體瓊脂凝膠中進行。,鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同,用于確定抗原濃度,沉淀反應(yīng)免疫電泳,存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結(jié)合，在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標準品相對比，可分析樣品的成分及其性質(zhì)。,第二節(jié) 免疫組織化學檢測技術(shù),抗原抗體（特異性）酶標記抗體，通過酶與底物作用生成有色反應(yīng)物，定位組織或細胞內(nèi)抗原的一門技術(shù)。 免疫組

12、織化學：用帶標記物的抗體或抗原在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)或組織化學反應(yīng)，對相應(yīng)抗或抗體進行定性、定量、定位測定的技術(shù)。,免疫組化分類 免疫組織化學技術(shù)按照標記物的種類可分為： 免疫熒光法 免疫酶法 免疫鐵蛋白法 免疫金法 放射免疫自顯影法 按標記抗體的方式分： 標記抗體IHCT法 非標記抗體IHCT法,非標記抗體IHCT法的二抗不被標記，用以免疫動物制備抗酶抗體，以酶-抗體再與二抗結(jié)合。 按染色步驟分： 直接法（一步法） 間接法（2步法或多步法）,一、檢測原理 通過免疫學中抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，用特異性抗體(單克隆或多克隆)或抗原檢測組織、細胞內(nèi)相應(yīng)的抗原或抗體物質(zhì)，形成抗原 - 抗體復合物；

13、利用此復合物上帶有預(yù)先標記的標記物，通過與標記物相對應(yīng)的檢測系統(tǒng)，如酶底物顯色反應(yīng)可使之呈現(xiàn)某種顏色，從而可檢測組織細胞內(nèi)的抗原，以達到診斷、鑒別診斷和研究的目的。 可作為抗原的物質(zhì)有 酶、 受體、 抗體、 細胞外基質(zhì) 激素、 細胞結(jié)構(gòu)蛋白、病原體。,二、免疫標記物顯色原理,免疫酶測定法 免疫熒光技術(shù) 放射免疫測定法 免疫膠體金技術(shù),免疫酶測定法,夾心法ELISA 間接ELISA BASELISA 利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁 微粒捕獲酶免疫分析技術(shù) 將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和素、酶相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過檢測熒光強度判斷未知抗原的含量。,免疫組化技術(shù),定位、

14、定性、定量檢測,免疫熒光技術(shù),海馬細胞 微管蛋白 綠色(胞體、樹突) 軸突終末蛋白 紅色(突觸),培養(yǎng)的成纖維細胞 微管呈綠色 核呈藍色,放射免疫測定,用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定。將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來，具有重復性好、準確性高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測。常用的有131I、125I。,化學發(fā)光免疫技術(shù),將化學發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。 靈敏度高、簡便、可實現(xiàn)自動化分析。,免疫膠體金技術(shù),用膠體金顆粒標記Ab/Ag，以檢測未知Ag/Ab的方法。 氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆

15、粒，形成帶負電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。 該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。,免疫印跡法-Western blotting,三、標記抗體的特點與應(yīng)用原理,1、一級抗體（第一抗體） 屬識別系統(tǒng)，特異性識別來自樣本的靶抗原。 常用單抗或多抗，實驗前-20 -40保存（1-2年有效），應(yīng)用液4約一周。一抗的使用濃度在不同實驗中是不一樣的，最佳用量需經(jīng)預(yù)實驗確定，一般選頂準陽性的稀釋度。 2、二級抗體（第二抗體） 連接放大和酶標顯色指示系統(tǒng)的抗體。屬橋連抗體，一手連一抗，一手連標志物（酶），根據(jù)一抗的物種來源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。,如要在實驗中同時確定一抗、

16、二抗的濃度，最簡單的是方陣（棋盤）滴定法。 3、非標志抗體IHCT和放大檢測系統(tǒng)的應(yīng)用原理 1）酶-抗酶法（PAP） 利用酶聯(lián)抗體將酶與組織切片中抗原相結(jié)合，通過與適當?shù)孜锓磻?yīng)（通常是H2O2）以及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine DAB)的顯色劑，產(chǎn)生一種不溶性棕色反應(yīng)產(chǎn)物。該法已被進一步改進發(fā)展為更敏感的多級橋聯(lián)法，后者利于增加在抗原部位反應(yīng)產(chǎn)物的沉積。,PAP法是酶-酶抗體(PAP)復合物（常用辣根過氧化物酶）組成的可溶性復合物為五環(huán)狀結(jié)構(gòu)，3個分子辣根過氧化物酶和二個抗體分子組成，極為穩(wěn)定，比免疫熒光法敏感100-1000倍，比酶橋法敏感20倍，其原理是特異性初級抗體（一

17、抗）的Fab段與組織抗原結(jié)合，二抗（橋抗）在一抗與PAP復合物之間形成分子橋聯(lián)（此時一抗與PAP中的免疫球蛋必須是同一種屬，以使得衍生自其它種屬的二抗，對一抗分子PAP中的FC段及穩(wěn)定成份都具有特異性），洗滌后用H2O2 和DAB顯色，陽性為褐紅色，陰性無色。,2）標記的親和素-生物素法（LSAB） 生物素是一種低分子量的維生素，可以與抗體（二抗）共價結(jié)合。親合素是一種從卵白素中提取的具有4 個生物素結(jié)合位點的糖蛋白，借生物素與親和素的結(jié)合，將抗體與酶相連，這一特性能使之成為多級免疫酶學系統(tǒng)各成分之間的橋接物。1981年Hsu 等人建立了抗體-生物素-親和素-過氧化物酶(AvidiN Biot

18、iN-peroxidase Complex ABC)系統(tǒng)。該方法是通過生物素相關(guān)的次級抗體將一抗連接到親和素-生物素-過氧化物酶復合物上。 比PAP法敏感8-40倍，特異性強、非特異性背景著色低、方法簡便、應(yīng)用廣。,ABC系統(tǒng)通過將鏈球菌抗生物素蛋白代替親和素蛋白而得到進一步改進，稱為鏈球菌抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)(StreptavidiN biotiN system SAB)。鏈球菌抗生物素蛋白在生理PH環(huán)境中為電中性，而不產(chǎn)生非特異性結(jié)合，而抗生物素蛋白在生理PH環(huán)境中帶正電荷。應(yīng)用抗生物素蛋白-生物素法時，內(nèi)源性生物素能與抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物直接結(jié)合而產(chǎn)生非特異性或稱假陽性染色

19、，避免的方法可先通過切片與游離抗生物素蛋白反應(yīng)以去除游離生物素。,葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal proteiN A SPA)是金黃色葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白成分， 單鏈多肽，分子量為42000，SPA最大的特點是能與不同種屬血清中免疫球蛋白分子穩(wěn)定FC段結(jié)合，此外還能與其它物質(zhì)如熒光素、過氧化物酶、鐵蛋白、膠體金等結(jié)合，并不影響其生物活性，因此被用來發(fā)展為一種簡便而迅速的免疫過氧化物酶法，即用SPA代替PAP技術(shù)中的次級抗體，因SPA可與多種動物的抗血清反應(yīng)，而不需因不同種動物而制備相應(yīng)的第二抗體。SPA可以結(jié)合大多數(shù)IgG分子，可以充當?shù)谝豢贵w和衍生自不同種屬的抗過氧化物酶

20、抗體的橋接物即SPA-過氧化物酶聯(lián)法。同時由于SPA與FC段的高親和力可以減少非特異性背景染色。,3）多聚螯合物法 將抗體和HRP共同連接在葡聚糖聚合物上，形成抗體多聚化合物酶。靈敏度高，每個聚合物有超過20個點與一抗結(jié)合。 4、現(xiàn)色系統(tǒng) 主要有DAB，AEC（ 3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC) ）均以HRP為供氫體。 固紅，固藍，氯藍四唑（NBT），以堿性磷酸酶為現(xiàn)色劑。,四、基本操作過程,全過程為：抗原制備與純化；抗體制備；標記抗體制備；標本采集與制備；免疫組化反應(yīng)與現(xiàn)色；結(jié)果觀察與分析。 1、標本采集與制備 石蠟切片 細胞爬片 冰凍切片 細胞涂片 組織印片 石蠟切片過程：取材固定沖洗脫

21、水透明浸蠟包埋切片貼片烤片脫蠟復水染色脫水透明封藏等步驟。,組織標本,組織標本,冰凍切片操作方法及技術(shù)要點： 取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24242mm。 取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細小組織，滴上包埋劑。 將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。 調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在510um間。,要注意的是： 組織快大小合適 選擇合適的冷凍度 未固

22、定過的組織-10-15， 脾、腎、肌肉等-15-20，含脂肪組織-25-30。 及時清除殘余的包埋劑，防止撕裂組織。 組織塊無須固定 用于附貼切片的載玻片室溫存放，無須冷凍。 切片不能馬上染色的可晾干低溫冷藏，或置組織培養(yǎng)液內(nèi)。0-4 保存。,2、免疫化學染色 酶法染色 免疫熒光染色 標本處理熒光試劑封片觀察 一般為冰凍切片，石蠟切片效果差。 免疫膠體金染色 免疫金銀染色 免疫雙重/多重標記染色 同一切片的同一組織上同時顯示2種/以上的抗原成分，也稱免疫組化雙染法。要求2種抗原分布于細胞不同部位。針對抗原使用不同顏色的熒光素、酶或不同直徑的顆粒。,五、免疫組化的影響因素與對策,1、非特異性著色

23、 由內(nèi)源性酶和生物素干擾 滅活酶，用親和素飽和生物素。 電荷吸附 BSA或二抗動物血清封閉非特異位點。 抗體原因 抗體不純或標本含與靶抗原類似的表位。用單抗。 洗滌不充分 加去污劑等洗。 DAB不溶性顆粒未除掉而沉積在組織上。 制片不當 壞死、變性、炎癥組織、切片拱起、皺縮、邊沿缺損等。二抗動物血清封閉或重切。,2、組化染色的假陰性 標本保存不當 老舊標本、固定不當或固定時間太長、溫度過高等，改善條件，重做。 抗體等試劑質(zhì)量差 滴度、純度、特異性或保存不當，更換新試劑再做。 操作失誤 嚴格按操作規(guī)程作。 3、雜音 免疫組化中的非正常的背景著色。 常見于抗體濃度過高、切片粘貼不牢，邊沿松動等,第

24、三節(jié) 免疫印跡技術(shù),1979年Renart and Towbin 將 Southern blotting 技術(shù)應(yīng)用與蛋白質(zhì)研究，并與酶免疫技術(shù)結(jié)合建立的蛋白檢測技術(shù)。 靈敏度高，1-5 ng。簡單、快速、經(jīng)濟。 目前，廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用研究和抗原性研究。,一、原理： 蛋白質(zhì)組分經(jīng)SDS-PAGE分離后，平行轉(zhuǎn)移到固相支持體（NC膜或PVDF膜）上，通過免疫試劑來檢測靶蛋白。 浸泡式電轉(zhuǎn)移的條件溫和，對蛋白樣本損失較小， 缺點是耗時長，需大量緩沖液；半干式電轉(zhuǎn)移時間 短，但有可能損傷樣品。今天采取浸泡式電轉(zhuǎn)移。 靶蛋白的檢測通常采用兩步法或間接法，用一抗結(jié) 合靶蛋白，再用過氧化物酶（HRP）

25、標記的二抗 結(jié)合一抗，然后HRP催化化學顯色反應(yīng)或化學發(fā) 光反應(yīng)。當前多采取化學顯色反應(yīng)。,免疫學檢測,封閉 加一抗 洗膜 加二抗 洗膜 加底物 試驗記錄,搖育過夜,搖育2h,（3次，每次10min ）,搖育1h,二、操作過程 1. SDS-PAGE 電泳 2. 電轉(zhuǎn)移： 將冷卻管接上水龍頭，接上電源，根據(jù)凝膠面積調(diào)節(jié)電流（0.65mA/cm2），時間2小時。 3. 電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，打開夾板，剪下NC膜左右上角做標記（即標記有蛋白結(jié)合面）。然后把NC膜分為兩份，其中一份放入氨基黑染色液中染色3060秒，10乙酸漂洗，觀察膜上有無蛋白條帶。 如果有，可用另一份繼續(xù)以下的實驗。,4. 封閉： （將N

26、C膜上無蛋白結(jié)合處封閉，防止探針的非特異性結(jié)合）在一培養(yǎng)皿內(nèi)倒入封閉液（5脫脂奶粉），將未染色的NC膜放入浸泡，室溫放置1小時。 5. 探針結(jié)合：封閉結(jié)束后，用PBS漂洗一次。倒干PBS后，加入HRP標記羊抗鼠IgG稀釋液，37C孵育1小時。,6. 孵育完成后，PBS漂洗三次（每次浸泡3分鐘），將未結(jié)合探針盡可能洗掉。倒干PBS后，加入底物工作液，避光顯色10分鐘，觀察顏色變化。 三、影響因素與對策 1、影響SDS-PAGE的因素 2、影響蛋白轉(zhuǎn)移的因素 轉(zhuǎn)移膜的活化與大小、緩沖液、是否平整、有無氣泡、電壓、溫度、轉(zhuǎn)移時間等。 3、封閉 封閉試劑濃度不能過高過低。 4、顯色 設(shè)立陰陽性對照，D

27、AB顯色后立即照相，否則易腿色。,酶免疫技術(shù)按目的分類 （一）酶免疫組織化學測定技術(shù) （二）酶免疫測定技術(shù) Ab *Ag Ab*Ag Ab* Ab Ag * AbAg * Ag* （1）Homogenous （均相測定） （2）Heterogenous（異相測定） Solid phase liquid phase,第四節(jié) 酶聯(lián)免疫檢測技術(shù),一、ELISA的基本原理 ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。這一方法的基本原理如下。 （1）使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性； （2）使抗原或抗

28、體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性又保留酶的活性。,二、基本操作流程,測定抗原常用雙抗體夾心法，測定抗體用間接法。 基本過程為： 固相包被（吸附已知成分、洗滌、封閉、洗滌） 加待測樣品 促反應(yīng) 洗滌 加酶結(jié)合物 促反應(yīng) 洗滌 加酶底物 促反應(yīng) 終止反應(yīng) 測定（比色、熒光）,ELISA的類型： ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。用于這些目的的檢測方法主要有以下幾種類型。 1 雙抗體(原)夾心法 2 間接法 3 競爭法 4 雙位點一步法 5 捕獲法測IgM抗體 6 應(yīng)用親和素和生物素的ELISA,ELISA的類型,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體

29、。在這種測定方法中有三個必要的試劑： （1）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）； （2）酶標記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物（conjugate）； （3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。,1、夾心法 過程：包被 加待測樣品 洗滌 加酶標記物 洗滌 加底物 測定 1）雙抗體夾心法測抗原,此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原（二價及以上），例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。,2）雙抗原夾心法測抗體,用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其

30、敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標記方法。,2、間接法測抗體 1）間接測抗體法,傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。,2）間接測抗原法,3、雙位點一步法,測定抗原 由雙抗體夾心改進而來，將雙抗體夾心中針對同一抗原決定簇的2種抗體改為針對抗原不同決定簇的2種單抗。敏感性和特異性大為提高。 但抗原過量，Ag分別與固相抗體和酶標抗體結(jié)合，抑制夾心復合物形成，出現(xiàn)所謂鉤狀效應(yīng)，甚至假陰性結(jié)果。 過程：Ab1包被 加待測樣品和酶標Ab2 洗滌 底物 也可用雙抗原夾心測抗體,4、競爭法測抗體 過程：將待測抗體（原）同時加入包被孔，洗滌除去酶標記物，加底物測定。,用于測定只有一個決定簇的小分子抗原或半抗原，當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。,競爭法測抗原,小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。,競爭ELISA檢測抗原,5、 捕獲包被法測抗體或I