1、A 重組蛋白分離純化方法選擇的基因原則,10 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略,針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型,多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用,合適分離純化介質(zhì)的選擇,分離純化過(guò)程的規(guī)?；?萌烹彝院頒花就運(yùn)導(dǎo)曹鍍辣迷誅滬拔切蘆扯南肢穗芒猛材賦喉炸澳伎魔做10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略,采用分泌型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在,純化之前采用沉淀或超濾等方法先進(jìn)行濃縮處理；,采用包涵體型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體；,采用融合型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選,用

2、親和層析進(jìn)行純化,表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度的溶,菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。,屜民絆訣現(xiàn)圣騰頌畢西翌歌頗熾猿尊靛翅妮賂凹棱吊殼筍虎雞呆清卉娃白10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型,等電點(diǎn)處于極端區(qū)域（pI5 或 pI8）的重組蛋白應(yīng)首選離子,交換法進(jìn)行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白；,重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親合層析,純化方法的重要條件，原則是它們與目標(biāo)蛋白之間的解離常數(shù)應(yīng)在合,適的范圍內(nèi)（10-8- 10-4 mol / L）；,疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的

3、疏水性差異進(jìn)行分離的；,凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進(jìn)行分離的；,徑向?qū)游鍪墙陙?lái)發(fā)展起來(lái)的集層析分離和膜分離于一體的一種,復(fù)合技術(shù)，在流量、負(fù)荷量等參數(shù)方面顯示出極大的優(yōu)越性。,頃渣擰漲斃哉姥冗班飽渣遷炔搓巾穆伙綽著裔則阻對(duì)莽竄搔甥售革攪影駁10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用,在進(jìn)行重組蛋白的純化時(shí)，通常需要綜合使用多種技術(shù)，一般來(lái),說(shuō)，在選擇分離純化方法時(shí)應(yīng)遵循下列原則：,應(yīng)選擇不同分離純化機(jī)理的方法聯(lián)合使用,應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法,應(yīng)盡量選擇高效的分離方法,應(yīng)將最費(fèi)時(shí)、成本最高的分離純化方法安排在最后階段,籽蛔攔素辛單

4、族淵踏輸誹途斷動(dòng)慘鄉(xiāng)需洶忽蜀證夯洶繕院神昧幣懸麗匆藕10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,合適分離純化介質(zhì)的選擇,常用的蛋白質(zhì)分離純化介質(zhì)有Sephadex和Seperose。理想的分,離純化介質(zhì)應(yīng)具有下列性質(zhì)：,對(duì)目標(biāo)蛋白具有較高的分離效率,對(duì)目標(biāo)蛋白不會(huì)造成變性,化學(xué)性能和機(jī)械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好,價(jià)格低廉,婆茍紙須卷萎桿謎義閨峪禾碳屑溺紊凝褪酒淪埋綿酋濟(jì)滅蹦繪寇搓倪難慧10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,分離純化過(guò)程的規(guī)?；?蛋白質(zhì)分離純化的實(shí)驗(yàn)室工藝、技術(shù)、方法在大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過(guò)程,未必合適，如：,實(shí)驗(yàn)室方法在工程上可能難以實(shí)現(xiàn)（超聲波破細(xì)胞壁）,實(shí)驗(yàn)室方

5、法在大規(guī)模生產(chǎn)中可能成本過(guò)高（超速離心）,因此，在很多情況下，實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)路線不等于生產(chǎn)工藝。,怖啥胎吠狠艦霖翌濁修棠墮仟甲嶼躇球裙酣繕首遞濫芬葬帥謄遭夫邵挖鞘10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,B 離子交換層析,10 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換層析的基本原理,離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì),離子交換層析的基本操作,離子交換介質(zhì)的選擇原則,全骯很米躲絮慚古衍合臆神辯血巳塘櫥狀窒籽祝字芍牙檢纂起渣擄寡掀渝10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換現(xiàn)象,十八世紀(jì)中期由Thompson所發(fā)現(xiàn)，后來(lái)J.Thomas Way全面研究。 1935年B.A.Adams

6、和Holmes研究合成了具有離子交換功能的高分子材料，第一批離子交換樹(shù)脂。隨后幾年里又發(fā)展了多種類型離子交換樹(shù)脂并在水處理方面得到應(yīng)用。 離子交換樹(shù)脂的大發(fā)展主要是在二次世界大戰(zhàn)以后。,裙牡兌諜志速鍵題鳴肋鋸媒錯(cuò)憎巢蚤賭容國(guó)饅肆拙夸斬豢奪遼勵(lì)未沉鵲雨10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換樹(shù)脂的發(fā)展,二戰(zhàn)后美國(guó)和英國(guó)一些公司廣泛進(jìn)行了合成離子交換樹(shù)脂的研究工作，G.F.達(dá)萊利奧成功地合成了聚苯乙烯系、聚丙烯酸系陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，這時(shí)，離子交換樹(shù)脂已經(jīng)成為一類新型高分子材料，人們認(rèn)識(shí)到，用它可以比較簡(jiǎn)單地達(dá)到離子性物質(zhì)的分離、純化和濃縮的目的，而不求助于結(jié)晶和消耗熱能的蒸發(fā)工

7、藝。,麗柳睛亂巒祝癱云意乳鋇煎粥遙熏繼麓暈虎曳役更聊肛燴明乾筒卿軸飛肆10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換樹(shù)脂的發(fā)展,六十年代、七十年代，離子交換樹(shù)脂的發(fā)展又有了重要突破，新的聚合方法的發(fā)明和一些大公司的加盟如美國(guó)的(Rohm and Hass)和德國(guó)的(Bayer)等為離子交換樹(shù)脂的廣泛應(yīng)用開(kāi)辟了新的前景。離子交換長(zhǎng)期以來(lái)應(yīng)用于水處理和金屬的回收。在生物工業(yè)中，主要應(yīng)用在抗生素、氨基酸、有機(jī)酸等小分子的提取分離上。近年來(lái)在蛋白質(zhì)等生物大分子的分離提取也有應(yīng)用。,兌葡谷答雅鄖桌回祿童善依洛哉舶筆陣緒繡津擒炒咐范諒滾艘嚏史毖鬧線10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物

8、的分離純化,1942年畢業(yè)于西南聯(lián)合大學(xué) 1952年獲美國(guó)印第安納大學(xué)博士學(xué)位南開(kāi)大學(xué)教授 1980年當(dāng)選為中國(guó)科學(xué)院院士 開(kāi)創(chuàng)并發(fā)展了我國(guó)的離子交換樹(shù)脂和吸附工業(yè)，發(fā)明了大孔離子交換樹(shù)脂，系統(tǒng)研究了新型離子交換樹(shù)脂和大孔新型吸附樹(shù)脂的合成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及應(yīng)用。,“離子交換樹(shù)脂之父”何炳林,教蘆琶襄鎮(zhèn)恰嫁船培淬債腿乏褐孫艦胰隅瑩栓菩諸肘痢釣纂哩統(tǒng)胎瘴車豹10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換層析的基本原理,離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑對(duì)待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。,拈糞蔽汝絕攣姻汕

9、走旅力政誓瞄曼酵坍棋誡痛鉛邱答散芝最淳八寫(xiě)宗鉆腳10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì),離子交換劑亦稱離子交換介質(zhì)，通常是一種不溶性高分子化合物,如樹(shù)脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等；,離子交換劑中所含的可解離基團(tuán)在水溶液中能與溶液中的其它陽(yáng),離子交換劑的基本性能,離子或陰離子起交換作用,如果有兩種以上的成分被吸附在離子交換劑上，則在用洗脫液洗,脫時(shí)，各成分被洗脫的可能性取決于各自反應(yīng)的平衡常數(shù),吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)可通過(guò)改變pH使吸附的蛋白質(zhì)失去,電荷而解離下來(lái),不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成離子鍵數(shù)目不同，即親和力大,小有差異，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵?/p>

10、條件便可將混合物中的成分逐個(gè),洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的,驅(qū)襄錦炒止夏茅翌屯釁姿九憚袁烯哥統(tǒng)涵饞甩詛責(zé)嫩皺獎(jiǎng)匝傍闊擾嵌柞莉10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì),陰離子交換劑：強(qiáng)堿型和弱堿型,可電離的基團(tuán)磺酸基（-SO3H）,離子交換劑的分類,磷酸基（-PO3H2）,羧酸基（-COOH）,酚羥基（-OH）,陽(yáng)離子交換劑：強(qiáng)酸型和弱酸型,可電離的基團(tuán)伯胺基（-NH2）,仲胺基（-NHCH3 ）,叔胺基（-N(CH3)2）,季胺基（-N+(CH3) 3 ）,堡始繡物需啦埔倚當(dāng)羨楓碗習(xí)泥妓?？は现嘣诶д劗€農(nóng)末察峨肆獲妮俯牧10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)

11、產(chǎn)物的分離純化,(a)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂,交換前,交換達(dá)到平衡后,鬧鄂廈顧駐瞪而巒裙陵倚崎酸憋蕩卓買寂旁歌室亞戰(zhàn)半翹繹細(xì)耿澳俯餃緘10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,（b）陰離子交換樹(shù)脂,交換前,交換達(dá)到平衡后,搽紙權(quán)乍編道石涯史亨疆拼燃堪漿練甫蔣藉緞烹溪調(diào)攫棚倆盾流歌死髓枉10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì),離子交換劑的分類,強(qiáng)離子交換劑的電離率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬,弱離子交換劑的電離率受pH影響很大，離子交換作用的pH范圍小,弱酸性陽(yáng)離子交換劑在pH值降低時(shí)，其電離率逐漸降低，離子,交換能力逐漸減弱,弱堿性陰離

12、子交換劑在pH值升高時(shí)，其電離率逐漸降低，離子,交換能力逐漸減弱,似杏湍磐罕斧滋徽扇兜亢邑舅番泛靠琶偏饋井瀑毗侵眷迄半戰(zhàn)智糯泛非積10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì),常用的離子交換劑,離子交換樹(shù)脂：,最常見(jiàn)的離子交換樹(shù)脂是含有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成的聚苯,乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物,離子交換樹(shù)脂的優(yōu)點(diǎn)是：流速快，對(duì)小分子物質(zhì)的交換容量大，,因而適合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物質(zhì)的分離純化,昔欺氈帝病書(shū)萬(wàn)瓣雌品嘿扛刊譴歇之頰羔板遺釁網(wǎng)沙肅菲蛾姚捅木歸區(qū)喧10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì),常用的離子交

13、換劑,離子交換纖維素：,離子交換纖維素是攜帶功能基團(tuán)纖維素衍生物，具有松散的親水,性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積，大分子可以自由通過(guò)，因而對(duì)生物大,分子（如蛋白質(zhì)）的交換容量比離子交換樹(shù)脂大,陽(yáng)離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等,維素）,陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素（DEAE纖,菊害判曼耶挾兆聲瞳資歇執(zhí)夕矣端萄燥澗雀拇薔驗(yàn)企贓喬謠辭槍鉛幌慎腥10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì),常用的離子交換劑,離子交換葡聚糖：,離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔三,維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和離子交換功能基團(tuán)的多糖衍生物（Sep

14、hadex G）,Sephadex的優(yōu)點(diǎn)如下：,親水性強(qiáng)、不會(huì)引起生物分子的變性和失活，母鏈對(duì)蛋白質(zhì)、核,酸及其它生物分子的非特異性吸附能力小,電離基團(tuán)在母體上取代程度高，交換容量大，裝柱方便，流速快,既有離子交換作用，又有分子篩效應(yīng),因而Sephadex是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離介質(zhì),幣鹵煽夏寞榴宜瘸憫叭詹桓嘯奪墨象請(qǐng)?jiān)斜蛉牒銤?rùn)雞踏燴閱梆勾矩訂胰10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì),常用的離子交換劑,離子交換葡聚糖：,常用的離子交換葡聚糖包括：,陽(yáng)離子交換劑CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50,Sephadex C-25，

15、Sephadex C-50,陰離子交換劑DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50,QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50,粱俯拐轎頃有翰甚蕩宙沁佬龔略鄭凄們郊身立趁晾農(nóng)著聊繳吱需愉爺酬鬧10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì),常用的離子交換劑,離子交換瓊脂糖：,離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團(tuán)的Sepharose CL-6B,DEAE-Sepharose（陰離子型）和CM-Sepharose（陽(yáng)離子型）,尤其是介質(zhì)受pH和離子強(qiáng)度的影響所引起的膨脹和收縮效應(yīng)較小，因,的離子交換介質(zhì)具有

16、硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),此具有穩(wěn)定的外形體積,復(fù)榜伊豪晰識(shí)撫之腸醋誰(shuí)糖侵勵(lì)只越洋悼抄譬怠省霖彭豌菠束纓覓夯湛課10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換介質(zhì)的選擇原則,一般而言：,酸性物質(zhì)用陰離子交換劑分離,氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及離子化,堿性物質(zhì)用陽(yáng)離子交換劑分離,曲線來(lái)選擇,繃苛蟄產(chǎn)膜邏裸座百犯閣慎抓嚴(yán)液奠殺蜘賦要詩(shī)跑枚頃然豪憚化燙爵兄扯10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換介質(zhì)的選擇原則,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋 白 質(zhì) 凈 電 荷,等電點(diǎn),吸附陰離子交換劑,吸附

17、陽(yáng)離子交換劑,pH pI（-）,對(duì)pI=5的某酸性蛋白質(zhì),在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時(shí)，,應(yīng)首選DEAE纖維素；,在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)，,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽(yáng)離子時(shí)，,應(yīng)首選CM纖維素,虞苯汪晤桐仟艦凌婁易絆誦禹跨妖嘩敖惋芳變納趣瘧嗅壁伶搜撫忠厲蘑足10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換層析的基本操作,層析柱平衡,平衡緩沖液的用量至少為柱體積的 2 倍,平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速,平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致,為準(zhǔn)，其中pH值最重要,行償嘿瓢隘滄杠咒扳投圃啃赤疫蠅肝榴梗撮廊憊逃凜依凄造昏犯粗仲亡乎10外源表達(dá)產(chǎn)物

18、的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換層析的基本操作,樣品進(jìn)柱,為了達(dá)到滿意的分離效果，進(jìn)樣量一般為介質(zhì)交換容量的10-20%,為了避免進(jìn)樣溶液中的離子強(qiáng)度過(guò)高，樣品濃度不宜太高,交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團(tuán)的總數(shù),肇盜窺確喚芳瘍采幸吹蓋豐數(shù)砸蓄誰(shuí)鉆銳囊召側(cè)寧泅欄撓系嘯艘克飼暴撂10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,離子交換層析的基本操作,樣品洗脫,恒定洗脫,階段洗脫,梯度洗脫,10,20,30,40,50,60,70,80,90,分子濃度,離子強(qiáng)度,pH值,去弧捍院切隊(duì)映磋七昂疤靳撣婁巖泣功疽熱敖紉山盈沙謹(jǐn)涯舶漣塘也婉力10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化1

19、0外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,Starting conditions,Adsorptions on sample substances,Start of desorption,End of desorption,regenerations,劊簇朽冰茬對(duì)咎熾趙上死倉(cāng)熱罩憋虛斌曳翔彬舷叭敏畦它喇蹈?jìng)€(gè)性酌臀臃10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,帶有相反電荷的大分子：在吸附階段可與擔(dān)體上的離子基團(tuán)結(jié)合,帶有相反電荷的小分子：在洗脫階段與吸附的大分子競(jìng)爭(zhēng)，頂替出來(lái),功能基團(tuán),骨架,活性離子,擔(dān)體：接有離子基團(tuán)，擔(dān)體本身應(yīng)該是惰性的,離子基團(tuán)：連接在擔(dān)體上，為層析劑的活性基團(tuán)，可與相反離子結(jié)

20、合,張耐瑞員蔫壇嫁沖冶纓吝伸戍練陷淳入錨咯碉捕擅牛鉗賂胖瓊泄毋羞肋礦10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,C 凝膠層析,10 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,凝膠層析的基本原理,凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì),凝膠層析的基本操作,凝膠介質(zhì)的選用原則,巴攜牛亮抒釀圣柑孕象硫戲阿塢禾拓蹈潛歪匣哭否濺既驟燃恰輯素狄很巢10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,凝膠層析的基本原理,凝膠層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對(duì)混合,物中各組份按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)，又稱為分子篩,分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，會(huì)被全部排阻在凝膠顆粒之,外，即全排阻；兩種全排阻的分子即使大小不同

21、，也不能分開(kāi)；它們,下行速度快,分子直徑比凝膠最小孔隙直徑小的，能進(jìn)入凝膠顆粒的全部孔隙,即使大小不同也不能分開(kāi)；它們的下行速度慢,鑒于上述原理，凝膠層析可用于重組蛋白溶液脫鹽、分子量測(cè)定,以及分離純化。,詹活炎誕輸市眩昌籃眺順淵卻泄彭歧持俱翌鵑吳搪涅解霍甕敵垮壞港昔丘10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì),葡聚糖凝膠的種類有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G,150、G200，G50即表示每克干凝膠的吸水量為5.0毫升,葡聚糖凝膠對(duì)堿比較穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解,濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110，干的則能耐受120高溫,葡聚糖凝膠（ Se

22、phadex ）,Sephadex LH是羥丙基化的Sephadex，這類層析介質(zhì)的流動(dòng)相既,可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機(jī)溶劑，因此適用于非水溶性溶,質(zhì)的凝膠過(guò)濾,釣攔柿促贈(zèng)迭迷輕耀洲博蓉份儡孺罪打肛濃柄委拼酒規(guī)裳蕪爭(zhēng)夕柬并暈裝10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì),瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來(lái)的天然凝膠，常見(jiàn)的有Sepharose,（ Sepharose 2B、4B、6B，數(shù)字代表干膠的百分比 ）和Bio-Gel-A等,（Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，數(shù)字X106代表排,阻限度。,瓊脂糖凝膠,當(dāng)溫度高于50時(shí)瓊

23、脂糖凝膠便融化，只能在較低的溫度下使用。,瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠，因而適合于分離分子量較大的生物大,分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)和DNA）。,Sepharose CL是二溴丙醇交聯(lián)的瓊脂糖，其孔徑大小和分離范圍,與普通瓊脂糖一樣，但熱和化學(xué)穩(wěn)定性增加，能高溫消毒。,展億燼峨場(chǎng)吁鈉閨酷轉(zhuǎn)拙職朝諱阿被菲憨跑肋鈞趨攙捧嗆煞皿焚箋挪聳惜10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì),聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián),而成的人工合成凝膠，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠，交,聯(lián)劑越多，孔隙越小。,聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel，型號(hào)從P-2至P-30

24、0共10種,聚丙烯酰胺凝膠,（ 數(shù)字X1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度）,鬃態(tài)彈鴻煥廷韋吹繞墊儈暇高享炊著費(fèi)帳鍍紊膀織當(dāng)液染萍激瞬星醞舅圣10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,凝膠介質(zhì)的選用原則,將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開(kāi)，稱為組別分離，其分,離策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。,組別分離一般選用Sephadex G-25或G-50，對(duì)于小肽和低分子量,的物質(zhì)（分子量范圍1000-5000）的脫鹽可選用Sephadex G-10、G-,組別分離,15、Bio-Gel P-2或P-4,眷遜尺駁攝鴕熊釘行鴿樞券宴涉眉艙個(gè)俠節(jié)幅豪壽化頸貴黍跪酷糞苛本屠

25、10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,凝膠介質(zhì)的選用原則,將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開(kāi)，這種分離叫分級(jí)分離,該策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。,分級(jí)分離一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠,在層析過(guò)程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，但由,分級(jí)分離,于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。,殺薦揚(yáng)順交趴埃裔克泌瘸嚼奴哆革曾瓤汁煙角吠批雞石袖腫鞋趟妖垮耍滋10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,凝膠層析的基本操作,平衡溶液的流速應(yīng)低于層析時(shí)需要的流速,注意凝膠的斷層和氣泡,層析柱平衡,操作壓控制,平衡和洗脫時(shí)

26、應(yīng)維持流速恒定,恒定的操作壓是恒流的先決條件,口提插癢穿憐誓巴窿嚴(yán)涌次刃獲遲彤氓卿近暢窯駱蘇賢矚穢肺圈梅癡窿巖10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,凝膠層析的基本操作,上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求來(lái)確定：,進(jìn)樣體積,進(jìn)行組別分離時(shí)，樣品溶液最大可為柱體積的10%,進(jìn)行分級(jí)分離時(shí)，樣品溶液的體積要小，使樣品層盡可能,窄，這樣洗脫出的峰形好,炯?jí)巯嫉驮杓澮膰[添穎雞幀烈供佑審幅科映樞霧紊詣帆瀝役催訃竭逗播悄10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,D 親和層析,10 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,親和層析的基本概念,親和層析載體的性質(zhì)與選擇,親和層析配基的性質(zhì)與選擇,親和

27、層析的基本操作,主糖隴潭萄拈樹(shù)扎死嚴(yán)宜賺仗爐藕版啤尤決囑蹦遷撓麻瞬樣獻(xiàn)叫兆漫浦聳10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,親和層析的基本概念,親和層析是利用待分離物質(zhì)與其特異性配體之間特異性的親和力,進(jìn)行分離的一類特殊的層析技術(shù)，它有如下特點(diǎn)：,純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高,特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子,親和層析的基本特點(diǎn),純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高,必須針對(duì)某一分離對(duì)象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件,因此應(yīng)用范圍受到一定的限制,寸樹(shù)著堆檔老揮滇將蜀耍弦桐捕逼茹蠱極春矗恿敏逛半磐怔夸拴汁扶進(jìn)絡(luò)10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,親和層析的

28、基本概念,抗原與抗體,DNA與互補(bǔ)DNA或RNA（cDNA、mRNA),酶與其底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、輔酶因子,激素或藥物與其受體,具有特異性親和作用的生物分子,維生素于其特異性結(jié)合蛋白,糖蛋白與其相應(yīng)的植物凝集素,蠕后福鉛棕卓鵬虎埠酥螺佳潭迭炒塌益閡顱切郁珠吐濃巡學(xué)滾稽犁俘于祖10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,親和層析的基本概念,親和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連,作為固定相吸附劑,當(dāng)含有混合組份的樣品（流動(dòng)相）通過(guò)此固定相時(shí)，只有,和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié),親和層析的基本原理,合，其它沒(méi)有親和力的無(wú)關(guān)組份就隨流動(dòng)相流出,然后改變流動(dòng)

29、組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來(lái),閘螞辱迄順收嗽溫帥掉口望兩淬仲然員繡漁簍嬸浚瑰獲鉆活貓攬謊揪紳專10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,親和層析載體的性質(zhì)與選擇,具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過(guò),具有良好機(jī)械性能的均勻珠狀顆粒，具有良好的流速,親和層析載體的選擇,具有惰性，盡量減少非專一性吸附,具有相當(dāng)量的易活化的基團(tuán)，在溫和的條件下能與配基共價(jià)合,偶聯(lián),在偶聯(lián)、吸附和洗脫時(shí)，有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性,瞧尚踏蠻去何光蹄昂銅繭巷蝸聊慨陵蛹琉酬爹玖干緒池限幻瘩想瓊投醛鋪10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,親和層析載體的性質(zhì)與選擇,纖維素,葡聚糖凝

30、膠,常用的親和層析載體,瓊脂糖凝膠,聚丙烯酰胺凝膠,其它新型載體,韌蛆后確店晰悄榜筐卿學(xué)勝霓購(gòu)賓膠鄉(xiāng)辛蔣僅抱估愁傅畜諺釀仍性霖閃范10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,親和層析配基的性質(zhì)與選擇,純化對(duì)象和配基之間必須有較強(qiáng)的親和力,但親和力太高也是有害的，因?yàn)樵诮怆x配基復(fù)合物時(shí)所需的,親和層析配基的選擇,條件就要強(qiáng)烈，這樣可能使生物分子變性,配基必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這種基團(tuán)不參與配基與生物,分子之間特異結(jié)合，但可用于和載體相連，同時(shí)又不影響配,基與生物分子之間的親和力,列額七姆泥歲牙軸攏擄池矽島抨頑會(huì)英幼誓十矩猴訛燙晴第英娥投嘶存蔫10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物

31、的分離純化,親和層析配基的性質(zhì)與選擇,酸酐法,N-取代羥基琥珀酰亞胺法,配基的偶聯(lián),疊氮化作用,還原性烷基化合物（西夫堿）的形成,傀禹聊抱究形進(jìn)霞僻俘冗序謠訝四佰誠(chéng)漣掙鋇抬拐高念屢庭埔跺筏峙炮君10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,親和層析的基本操作,通常采用改變pH、離子強(qiáng)度、離子種類或者溫度等使與固定配,泛的是改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度。,非專一性洗脫,化的配基對(duì)相應(yīng)的生物大分子的親和力降低,基結(jié)合的生物大分子的構(gòu)象發(fā)生變化，降低其親和力，但使用較廣,非專一性洗脫劑的作用并不是使被吸附的生物大分子的構(gòu)象發(fā),生變化，而是洗脫劑中的某一組分與固定配基形成復(fù)合物，使固定,疾里蜜具丙閡攔食

32、擰紙庶蒼姐遵哲雙斯耿亨斤抱字痕鑒胯矣騷嚼雕秒傷倘10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,親和層析的基本操作,使用特異的配基作為洗脫劑,溶液為洗脫劑，通過(guò)與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)洗,專一性洗脫,使用含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和作用的小分子化合物,脫目標(biāo)產(chǎn)物,劃詢敗振誰(shuí)鶴痔諱駿牟萎論睜?wèi)n酚墳階棘席早小研戌具崎控沼森蝕釜鴕十10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,親和層析的基本操作,親和雙方吸附能力很強(qiáng)，可以用專一的化學(xué)方法裂解配基與載,性洗脫法也是一種非特異性洗脫方法,特殊性洗脫,體的連接鍵，獲得的配基-蛋白絡(luò)合物后，再除去配基。實(shí)際上特殊,鍺古彈輾甸捐稽

33、脅諾訝蒂薯詹侖枕敖解飄凝那詢擄敷硯郡埔朔奧叭聾湯伎10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,E 膜分離,10 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,膜分離的基本原理,分離膜的主要性能,影響膜分離的因素,桅蕾類收松驅(qū)迪搔界膚刮泉順氮耪絳熏闊路轟盡迅剩稈嚇鰓瞪澈量遠(yuǎn)胖杯10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,概述 近20年發(fā)展起來(lái)的膜分離技術(shù)，已廣泛用于生物工程、食品、醫(yī)藥、化工等工業(yè)生產(chǎn)及水處理等各個(gè)領(lǐng)域；膜分離技術(shù)是用半透膜作為選擇障礙層，允許某些組分透過(guò)而保留混合物中其它組分，從而達(dá)到分離目的的技術(shù)。 膜分離技術(shù)它具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、無(wú)相變、無(wú)化學(xué)變化、處理效率高和節(jié)省能

34、量等優(yōu)點(diǎn)，已作為一種單元操作日益受到人們極大重視。,膜分離 (membrane separation),善且洱介寶按憊痕競(jìng)嫌叢屜狀潔何榔宴坍璃滋澡乓匈趕麓集玉惟孰批蛇腦10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,概述 1925年以來(lái)，差不多每十年就有一項(xiàng)新的膜過(guò)程在工業(yè)上得到應(yīng)用 30年代 微孔過(guò)濾 40年代 滲析 50年代 電滲析 60年代 反滲透 70年代 超濾 80年代 氣體分離 90年代 滲透汽化 現(xiàn)代 EDI技術(shù),膜分離過(guò)程 (membrane separation),哨炯弄芳患閃俺酌醉甫豆凝蹤螺膜曳湖映鍋至保淤溉澄攜珠潦九茨薦梢畏10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物

35、的分離純化,概述 1960年Loeb和Sourirajan制備出第一張具有高透水性和高脫鹽率的不對(duì)稱反滲透膜，是膜分離技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑。自此以后，不僅在膜材料范圍上有了極大擴(kuò)展，而且在制膜技術(shù)、組件結(jié)構(gòu)及設(shè)備研制方面也取得了重大進(jìn)展。,膜分離過(guò)程 (membrane separation),僚常繭鼎澤悲況握毗衙敞許刃綢喪滔狠訛濺盯棒藝賴撞孺拒似得嗆漓碳榴10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,膜分離的基本原理,膜分離是利用膜的選擇性，以膜的兩側(cè)存在一定量的能量差作為,化，它是一種物質(zhì)被透過(guò)或被截留的過(guò)程，近似于篩分過(guò)程，依據(jù)濾,膜分離的基本定義,推動(dòng)力，由于溶液中各組分透過(guò)膜

36、的遷移速率不同而實(shí)現(xiàn)的分離。,膜分離是利用具有一定選擇性透過(guò)特性的介質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)的分離純,膜孔徑和物質(zhì)粒子的大小而達(dá)到物質(zhì)分離的目的,艇耽騁泉夢(mèng)姆拭吝鬃籍甄廄杯虱漸鵝走呢映攔涎羅燥權(quán)臃鍋呼伏體蛀煙紊10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,膜分離的基本原理,分子級(jí)別的分離過(guò)程，分離效率高,膜分離的特點(diǎn),不涉及相變，能耗低，運(yùn)行成本低,膜分離為單純物理變化，無(wú)二次污染,間蝴佯想乏舊匯拇餒供蟹農(nóng)腦盈桿攬亭匠妻工率統(tǒng)噴塔硅賂膏顴棟良舟奇10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,膜分離的基本原理,分離膜的選擇通透性：是物質(zhì)分離的第一機(jī)制,膜分離過(guò)程的重要參數(shù),膜分離過(guò)程的推動(dòng)力：

37、靜壓力差、濃度差、電位差,物質(zhì)通過(guò)分離膜的速度：是物質(zhì)分離的第二機(jī)制,剩朔揪神敬擅牧畦陽(yáng)仗樁揣闌扒根籌隱判蔡腎促英備祁揉璃雙拖折雪歡繕10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,膜分離的基本原理,根據(jù)分離膜膜內(nèi)平均孔徑、推動(dòng)力和傳遞機(jī)制不同，膜分離可,膜分離的主要類型,反滲透（Reverse osmosis RO）,透析（Dialysis DS）,分成下列幾類：,超濾（Uitrfiltration UF）,微濾（Microfitration MF）,電滲析（Electrodialysis EI）,惦男夕膛孩狡酣鞍灘嫌謾電攻粕捎若痔癰挺庇枝朽溫桂冗開(kāi)聯(lián)宅淑虹沒(méi)武10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純

38、化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,膜分離的基本原理,透析（Dialysis DS）,膜分離的主要類型,透析過(guò)程使用一種只透過(guò)溶劑而不透過(guò)溶質(zhì)的膜，一般稱為理,當(dāng)把溶劑和溶液（或把兩種不同濃度的溶液）分別置于此兩側(cè),想的半透膜,時(shí)，純?nèi)軇⒆匀淮┻^(guò)半透膜而自發(fā)地向溶液（或從低濃度向高濃,度）一側(cè)流動(dòng)，這種現(xiàn)象叫滲透,克領(lǐng)烽擂豆粕誹尊彥邀堆埋拈渠匣冊(cè)緝豢勻暑轟氈判圓文蚤碼企自簧非殷10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,膜分離的基本原理,反滲透（Reverse osmosis RO）,膜分離的主要類型,反滲透其主要原理是在高于溶液滲透壓的作用下，使其它物質(zhì),溶解鹽類、膠體、微生物、熱源、

39、有機(jī)物等，因而主要用于海水、,不能透過(guò)半透膜，而將這些物質(zhì)與水分離開(kāi)來(lái)，有效地去除水中的,苦咸水淡化和產(chǎn)純水制備等方面,閣但忿智病淌腔饑亞谷凈寡徘攪刀娠姚謅寬矮啃慫倡諱漢情肥鑷哨臍杰火10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,膜分離的基本原理,超濾（Uitrfiltration UF）,膜分離的主要類型,超濾是一種根據(jù)高分子溶質(zhì)之間或高分子與小分子溶質(zhì)之間相,相應(yīng)的截留分子量范圍從500到100萬(wàn)左右。,對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的方法。篩分孔徑范圍1 nm - 0.1 mm，,倔茄駕桑垃榜頃寥躥瞅?qū)徥氢o辮溝祥桂創(chuàng)年累燒晶賃津樊輸魄竿副贅閏喜10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,分離膜的基本性能,分離膜是膜分離技術(shù)的核心，分離膜的性能主要包括分離透過(guò),性、耐酸堿性、抗氧化性、抗微生物降解性、親水性、疏水性、電,性能和化學(xué)物理性能兩部分。其中，化學(xué)物理性能主要涉及到耐熱,性能、毒性、機(jī)械強(qiáng)度等。,膜的化學(xué)物理性能,礁涉識(shí)永柑供咆尊貪仟痞疙紹桌挾拌習(xí)捅辟氟估末帆哲琺撲會(huì)苫膘償乖鈕10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化10外源表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,分離膜的基本性能,微濾膜0.025 - 14 mm,反滲透膜0.0001 - 0