1、熒光偏光免疫分析-by沈未、熒光偏光(fluorescence polarization，F(xiàn)P )通常在：垂直方向(、)的偏光下激發(fā)熒光分子，然后放射偏光的垂直方向(、)和a多生物學(xué)檢查，因?yàn)閿?shù)據(jù)分析和相關(guān)物理殘奧儀的解釋容易、FP值以比例，一般通過mP表示(1P=1000mP )。 在分子未固定即完全偏振的情況下，F(xiàn)P值為P0=1000 mP，在理論上的最大值即一個(gè)分子可以自由運(yùn)動(dòng)的系統(tǒng)中，根據(jù)分子的運(yùn)動(dòng)速度的快慢，熒光偏振值約為0 500 mP之間另一方面，當(dāng)待測(cè)樣品中競(jìng)爭(zhēng)抗原的濃度增加時(shí)，熒光標(biāo)記抗原以游離的形式存在于樣品中，F(xiàn)P值降低，通常在30-60 mP下完全被抑制，F(xiàn)PIA是均勻

2、的競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法，反應(yīng)完全在溶液體系中，不與結(jié)合的抗體結(jié)合。 實(shí)驗(yàn)操作過程非常簡(jiǎn)單，只需將抗體、熒光標(biāo)記抗原和抗原放入反應(yīng)杯，經(jīng)過幾分鐘甚至幾秒鐘的溫度培養(yǎng)就可以直接測(cè)定，很快就可以得到被測(cè)定抗原的濃度。 組蛋白對(duì)DNA熒光偏振度的影響，1 .制備的DNA-組蛋白復(fù)合物： -DNA(48kbp )用熒光染料YOYO-1標(biāo)記，堿基對(duì)染料分子的比為10:1； 用Bis-Tris緩沖液(50mmol/L、pH6.6)稀釋組蛋白溶液。 組蛋白濃度是DNA的10500倍的DNA/YOYO-1溶液(6.5 pmol/L )和稀釋的組蛋白溶液一起保溫(37 )培育3h，反應(yīng)液體積為2mL。 組蛋白對(duì)DNA

3、熒光偏振度的影響，2 .熒光偏振度測(cè)定：用MOS-450/CD進(jìn)行測(cè)定，是標(biāo)準(zhǔn)的熒光偏振度測(cè)定模式。 在測(cè)量熒光偏振度的情況下，偏振彈性調(diào)制器自動(dòng)地設(shè)定為半波長(zhǎng)模式，由此使用在水平分量和垂直分量之間以100 kHz的頻率變換激發(fā)光的Bio-Kine軟件(Bio-Logic )從2個(gè)散射信號(hào)實(shí)時(shí)地校正熒光強(qiáng)度和熒光偏振度， 組蛋白對(duì)DNA熒光偏振度的影響，3. DNA-組蛋白復(fù)合物熒光偏振度根據(jù)組蛋白和DNA濃度比變化的關(guān)系曲線，組蛋白對(duì)DNA熒光偏振度的影響，4 .圖表的解釋：在溶液中單獨(dú)存在時(shí)，DNA分子隨機(jī)卷曲， 有彈性的配置在對(duì)應(yīng)于一定偏振度值的組蛋白的作用下，DNA分子凝聚的DNA-組

4、蛋白分子更密，呈現(xiàn)更小的配置，復(fù)合體分子比DNA分子旋轉(zhuǎn)快，可能對(duì)應(yīng)于小的熒光偏振度值。 熒光偏振研究的一般步驟，1 .確定最佳熒光標(biāo)記物2 .確定公式的各種殘奧儀3 .倍比稀釋結(jié)合物基于不同的FP值確定最佳稀釋比，使其結(jié)合能力與FP值呈線性關(guān)系4 .創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線5 .分析結(jié)果，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)熒光偏振免疫分析的優(yōu)點(diǎn)，1 .不需要均勻系統(tǒng)、清洗操作，能夠大幅減少試劑的使用量。 2 .檢查速度快，自動(dòng)化方便，適用于快速篩選檢查。 3、熒光標(biāo)記抗原均勻性好，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存，方法重現(xiàn)性好。 4.FP值為一個(gè)比，與其他熒光檢測(cè)技術(shù)相比，不易受溶液顏色和機(jī)器靈敏度變化的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，可靠性高。

5、5 .通過使用不同發(fā)光波長(zhǎng)的熒光素進(jìn)行多標(biāo)記檢查，可以進(jìn)行多目標(biāo)的同時(shí)定性定量分析。 像四甲基若丹明一樣，由于激發(fā)、發(fā)射光譜和熒光素的重疊較少，相互之間幾乎沒有干擾，目前正在應(yīng)用于多標(biāo)記檢查。 熒光偏振免疫分析的缺點(diǎn)是1. FPIA比ELISA法靈敏度低。 一般來(lái)說，F(xiàn)PIA的檢出極限為0.1-10ng/mL-1左右。 2.FPIA易受樣品基質(zhì)(例如與基質(zhì)蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合)、背景熒光和光散射的影響。 3.FPIA的檢測(cè)信號(hào)的背景高，檢測(cè)范圍(窗口)窄，信噪比(S/N )低。4. FPIA對(duì)熒光標(biāo)記物的純度要求很高，需要更復(fù)雜的純化工藝。 5. FPIA檢查需要特定的分析儀器，或在通常的熒光分光光度校正中追加測(cè)量偏光附件。 因此，比通常的酶標(biāo)記物價(jià)格要高。 本實(shí)驗(yàn)室研究的思路是：當(dāng)研究對(duì)象為與核酸(DNA/