1、病毒感染的檢查方法,一、標本采集與送檢,原則： 1.盡早采?。喊l(fā)病初期 2.部位適宜：由感染部位采取 3.冷藏速送：裝有冰塊或干冰的容器內(nèi),（一）供分離病毒、檢出核酸及抗原的標本,（二）檢測特異性抗體 的標本 采集雙份血清，4-20保存,病毒分離是診斷病毒感染的金標準，一旦陽性，即可確診。 不適用于快速診斷，操作復(fù)雜，實驗成本高，陽性檢出率低等 有時不得不分離病毒，例如發(fā)現(xiàn)了一種新的病毒病，必須分離病毒進行研究，或者分離株的鑒定對流行病學(xué)有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫苗，或者希望獲得天然弱毒株等。,二、常規(guī)分離與鑒定,（一）病毒分離,（二）病毒鑒定,1. 形態(tài)學(xué)鑒定,觀察CPE。常見

2、的細胞形態(tài)學(xué)變化為細胞變圓、壞死、溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能形成包涵體。,正常細胞,病變細胞,感染細胞具有吸附紅細胞的能力 感染細胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在，具有凝集紅細胞的作用,2. 血吸附和血凝作用,多見于以出芽方式釋放的病毒。,紅細胞吸附,正常細胞,（1）血吸附作用,吸附試驗可通過特異抗血清抑制來達到鑒定具有吸附特性的病毒,（2）血凝作用,血凝試驗,血凝抑制試驗,（3）病毒成分的直接檢測,用免疫學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)直接檢查感染細胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。,三、 電子顯微鏡檢查,病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進行檢查。對于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型

3、的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。,透射電子顯微鏡,1. 正染法：超薄切片法,雞痘病毒（超薄切片）,超薄切片法的優(yōu)缺點：,優(yōu)點：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程 缺點：操作復(fù)雜，費時，但標本可長時間保存,2.負染技術(shù),負染是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強樣品外周的電子密度，使樣品顯示負的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。,銅網(wǎng),樣品,濾紙,染液（常用磷鎢酸）,1-2分鐘后電鏡觀察,口蹄疫病毒的電鏡負染,負染法的優(yōu)缺點：,優(yōu)點：快速簡易（10-20min）；分辨率高；圖象清晰地病毒結(jié)構(gòu) 缺點：敏感性低，要求病毒量在107以上

4、；所有樣品應(yīng)處于懸浮狀態(tài),免疫電鏡技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對抗原物質(zhì)進行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。,3.免疫電鏡技術(shù)(Immune electron microscopy，IEM),（1）免疫凝集電鏡技術(shù),抗原與抗體凝集反應(yīng)后，可使標本中病毒顆粒聚集成團，再經(jīng)負染直接在電鏡下觀察，提高了敏感性，確定病毒的血清學(xué)性質(zhì)。,（2）免疫電鏡定位技術(shù),特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、過氧化物酶等標記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。,酶標記染色,四、 血清學(xué)試驗,是一種常用的診

5、斷病毒病的方法?？刹捎肊LISA、瓊脂擴散、中和試驗、標記抗體技術(shù)等免疫血清學(xué)方法檢查病畜的抗體消長情況和發(fā)病組織中的病毒抗原。,virus,1.中和反應(yīng),觀察特異性抗體能否保護易感的試驗動物死亡，能否抑制病毒的細胞病變效應(yīng)。凡能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體又稱中和抗體。,2.補體結(jié)合反應(yīng),溶血 （-）,不溶血 （+）,3.免疫擴散,4.酶聯(lián)免疫吸附試驗 （ELISA）,將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測定時，將待檢標本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。然后加入酶的作用底物催化顯色，進行定性或定量測定。,（1）間接ELISA,（2）夾心ELISA,五、分子生物學(xué)技術(shù),聚合酶鏈反應(yīng) （PCR）,2. 核酸雜交技術(shù),核酸探針（probe）是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸片段，可檢測待檢樣品中特定的基因順序。,六、 感染組織的組織學(xué)檢查,病毒在光學(xué)顯微鏡下無法看到，但是在某些病毒感染細胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體，或者細胞形態(tài)發(fā)生變