1、研究生實(shí)驗(yàn),一、 T細(xì)胞表型測定（一） 二、小鼠脾細(xì)胞分離技術(shù),濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 邸大林 Tel：2608468 Email：,實(shí)驗(yàn)一、T細(xì)胞表型測定（一） -免疫細(xì)胞的分離、細(xì)胞涂片、固定及保存,原理： T細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的，不均一的整體，根據(jù)其發(fā)育的不同階段，表面標(biāo)記以及功能，可將其分為不同的亞群。T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且對B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答起到輔助和調(diào)節(jié)作用。,T細(xì)胞共有標(biāo)志：CD3+為總細(xì)胞 T細(xì)胞特有標(biāo)志：CD4+細(xì)胞為輔助細(xì)胞， CD8+細(xì)胞為殺傷細(xì)胞。,T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志,正常值：,正常人外周血中：CD3為60% 80%；CD4為35% 55%；CD8為20% 30

2、% CD4/CD8的正常值約1.42.0。 CD4CD81.4： 免疫缺陷病，如艾滋病的比值常小于0.5； 惡性腫瘤； 再生障礙性貧血； 某些病毒感染。 CD4CD82.0：自身免疫性疾病，如SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。,T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測，有助于了解機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，對免疫缺陷病、腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥反應(yīng)等疾病的診斷、分型、預(yù)后和療效觀察有著重要的意義。,SABC-AP法測定T細(xì)胞亞群,SABC：為鏈酶親和素生物素，AP為堿性磷酸酶。 鏈酶親和素：是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子結(jié)合。親和素與生物素一經(jīng)結(jié)合就極

3、為穩(wěn)定，形成一種類似晶格的復(fù)合體。,實(shí)驗(yàn)基本流程,實(shí)驗(yàn)材料,肝素、淋巴細(xì)胞分層液、Hanks液、PBS等； 一次性注射器、試管、滴管、離心機(jī)、微量移液器、玻片、顯微鏡，溫箱等。 鼠抗人CD3、CD4、CD8 單克隆抗體（1抗）；羊抗鼠IgG（生物素化2抗）；SABC-AP；底物（BCIP/NBT 磷酸甲苯胺藍(lán)鹽）等。,實(shí)驗(yàn)步驟,標(biāo)本的制備：淋巴細(xì)胞懸液的制備 標(biāo)本的染色： 結(jié)果的觀察：,標(biāo)本制備：淋巴細(xì)胞懸液的制備,（1）取肝素抗凝血5ml與5ml Hanks液稀釋混勻，每組取2ml，用滴管貼管壁輕輕疊加于2ml分離液上，配平后1500rpm離心10mins。 （2）洗滌細(xì)胞：用滴管仔細(xì)吸出位

4、于血漿和分離液之間乳白色的淋巴細(xì)胞，放入盛有2ml Hanks液的試管，1500rpm離心10mins，棄上清，將沉淀的淋巴細(xì)胞輕彈混勻后加入Hanks液重復(fù)洗滌一次，最后一次用PBS洗滌。 （3）棄去上清，淋巴細(xì)胞沉淀用200lPBS溶解，取20l細(xì)胞涂片，下一次實(shí)驗(yàn)檢測T細(xì)胞亞群用。,標(biāo)本染色,細(xì)胞涂片用記號筆劃圈，滴固定液1滴，室溫固定23分鐘。 滴加鼠抗人CD3、CD4、CD8抗體15L，輕輕搖晃，使單抗均勻鋪在細(xì)胞表面，37孵育23h，PBS洗3次。 滴加生物素標(biāo)記羊抗小鼠抗體15L ，37孵育3045分鐘，PBS洗3次。 滴加SABC 15L ，37孵育3045分鐘，PBS洗3次。

5、 滴加顯色劑3050L ，室溫顯色2040分鐘?？稍陲@微鏡下觀察，待細(xì)胞膜上出現(xiàn)紅色標(biāo)記物時(shí)，用PBS淋洗。 滴加細(xì)胞核復(fù)染液1滴，30秒后自來水淋洗。 顯微鏡下觀察結(jié)果。,注意事項(xiàng)：,以上操作中，37孵育時(shí)應(yīng)將玻片置于濕盒中，切勿干片，特別是加底物后，干片將導(dǎo)致陰陽性結(jié)果不能分辨。 觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)使涂片保持濕潤。,觀察結(jié)果,高倍鏡下計(jì)數(shù)100200個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。計(jì)算陽性率。陽性細(xì)胞：細(xì)胞表面呈紅色。標(biāo)準(zhǔn)陽性：細(xì)胞表面呈紅色，可見深藍(lán)色細(xì)胞核；強(qiáng)陽性：細(xì)胞周緣及中央均呈紅色，看不見細(xì)胞核；弱陽性：細(xì)胞表面呈淡紅色，可見淡蘭色細(xì)胞核；陰性細(xì)胞：細(xì)胞表面無著色反應(yīng)，呈淡蘭色。,注意事項(xiàng)：,為防止試劑

6、受到污染，加樣器吸頭最好為一次性使用。 分離單個(gè)核細(xì)胞中，將稀釋血液加于分層液上時(shí)，務(wù)必要使之形成良好的界面，否則影響分離結(jié)果。 孵育過程中，應(yīng)將涂片置于濕盒中，操作中始終要注意保持涂片的濕潤，以確保得到完美的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 淋洗時(shí)不要直接對著細(xì)胞沖，避免細(xì)胞脫落。 淋洗后，加試劑前須擦干細(xì)胞圈外水分，以免試劑流散。,實(shí)驗(yàn)二 小鼠脾細(xì)胞分離與制備技術(shù),分離小鼠脾細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，胎盤藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。,實(shí)驗(yàn)材料：,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠。 細(xì)胞培養(yǎng)液。 試管，滴管，離心機(jī)，培養(yǎng)皿， 100目細(xì)胞篩等。,選擇小鼠，拉脫頸椎處死，用碘酒、酒精消毒皮毛。剪開皮膚，打開腹腔。找到紅色的脾臟，用鑷

7、子分離后摘除。 將脾臟放入盛有5-10ml培養(yǎng)液的平皿中輕輕漂洗，并細(xì)心剝除脾臟周圍的結(jié)締組織。 將脾臟移入另一個(gè)盛有5-10ml培養(yǎng)液的平皿中，輕輕漂洗后置于100目細(xì)胞篩中，輕輕擠壓使脾細(xì)胞通過篩孔進(jìn)入培養(yǎng)液中，反復(fù)沖洗，以取得脾細(xì)胞懸液。,1、分離小鼠脾細(xì)胞,收集分離出的脾細(xì)胞，置于10ml離心管內(nèi)加入培養(yǎng)液吹打，取10l細(xì)胞，與10l胎盤藍(lán)染液混勻后染色并觀察細(xì)胞活力，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 細(xì)胞活力觀察（臺(tái)盼藍(lán)染色）：細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA 結(jié)合，被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。 細(xì)胞計(jì)數(shù)：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板。,2、細(xì)胞

8、活力觀察及計(jì)數(shù),材料： 4%臺(tái)盼藍(lán)母液（稱取4g臺(tái)盼藍(lán)，加蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml，用濾紙過濾，4保存。使用時(shí)，用PBS稀釋至0.4%）、 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、顯微鏡等。 步驟：制備單細(xì)胞懸液；染色：取10l細(xì)胞懸液與10l臺(tái)盼藍(lán)溶液并混勻；計(jì)數(shù)：在三分鐘內(nèi)，用計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。 注意事項(xiàng)：臺(tái)盼藍(lán)對人體有毒，盡量避免直接接觸。染色時(shí)間不宜過長，否則，部分活細(xì)胞也會(huì)著色，會(huì)干擾計(jì)數(shù)。,臺(tái)盼藍(lán)染色,細(xì)胞計(jì)數(shù)：,步驟：用乙醇清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干；用微量移液器取少許細(xì)胞懸液（10l），將細(xì)胞樣本從室的一個(gè)口注入，液體在室中擴(kuò)散，空氣從另一個(gè)口排除；觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞濃度。 注意事