1、病毒增殖技術(shù),動物增殖病毒技術(shù) 禽胚增殖病毒技術(shù) 細(xì)胞增殖病毒技術(shù),一、動物增殖病毒技術(shù),選擇動物的標(biāo)準(zhǔn)： 大動物應(yīng)來源于非疫區(qū)，最好是未接種過相應(yīng)病毒疫苗、青壯年和健康(經(jīng)臨床檢查、檢疫)； 對相應(yīng)病毒易感，并十分敏感； 經(jīng)隔離飼養(yǎng)和觀察檢查證明健康； 家兔、小鼠、大鼠等應(yīng)符合普通級或清潔級實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)；雞應(yīng)屬非免疫雞或SPF級標(biāo)準(zhǔn)；犬和貓應(yīng)品種明確，并符合普通級實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)； 體重、年齡要基本一致，個(gè)體差別不宜過大。,二、禽胚增殖病毒技術(shù),（一）禽胚的選擇 SPF雞胚 據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，無22種特定病原體 非免疫雞胚 應(yīng)無特定病原的母源抗體， 普通雞胚 可能帶有雞的多種病原體，不適用于疫苗生產(chǎn)

2、異源性性疫苗：鴨胚和鴿胚,（二）禽胚接種途徑與收獲,絨毛尿囊膜接種法 尿囊腔接種法 卵黃囊接種法 羊膜腔接種法 靜脈接種法 腦內(nèi)接種法,雞胚絨毛尿囊膜接種法,尿囊腔接種法,尿囊液收獲方法,雞胚卵黃囊接種法,1種蛋質(zhì)量 病原微生物：垂直傳遞，如白血病、腦脊髓炎、腺病毒、支原體及傳染性貧血因子等。 母源抗體： 抗生素：立克次氏體和鸚鵡熱衣原體 2孵化技術(shù) 溫度：3739.5。傳染性支氣管炎病毒37 濕度：雞胚5357，水禽胚比雞胚高510。 通風(fēng)：氧氣，二氧化碳。 翻蛋：,（三）影響禽胚增殖病毒的因素,3接種技術(shù) 不同病毒的增殖有不同的接種途徑， 同一種病毒接種不同日齡禽胚獲得的病毒量也不同。 接

3、種日齡：雞胚1314日齡。鴨胚1516日齡，尿囊液含 量最高，平均約68ml，羊水約12ml。 接種部位：不應(yīng)傷及胚體和血管，以免影響其發(fā)育 嚴(yán)格防止禽胚污染 雞胚接種時(shí)嚴(yán)格無菌操作； 定期清掃消毒孵化室，保持室內(nèi)空氣新鮮； 種蛋入孵前先用溫水清洗，消毒，涼干。,三、細(xì)胞增殖病毒技術(shù),1細(xì)胞培養(yǎng)的概念 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至24個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)行培養(yǎng)。,細(xì)胞分類：根據(jù)細(xì)胞染色體和繁殖特性 原代細(xì)胞(primary cell) 細(xì)胞株(cell strain) 傳代細(xì)胞（continued cell line） 細(xì)胞系(ce

4、ll line),（1）原代細(xì)胞(primary cell) 指由新鮮組織經(jīng)剪碎和胰酶消化制備的細(xì)胞，如CEF細(xì)胞。 （2）細(xì)胞株(cell strain) 又稱二倍體細(xì)胞 指自繼代培養(yǎng)的細(xì)胞中選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標(biāo)記的細(xì)胞。這類細(xì)胞且能保持原來的二倍染色體數(shù)目，能連續(xù)傳很多代(50100代)，但為有限生命；沒有腫瘤原。如PKl5、BHK21和Vero （3）傳代細(xì)胞（continued cell line） 細(xì)胞系(cell line) 能在體外無限傳代，應(yīng)用方便，其染色體數(shù)目及增殖特性均類似于惡性腫瘤細(xì)胞，且多來源于癌細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞系,靜置培養(yǎng) 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)(suspen

5、sion cell culture ) 微載體培養(yǎng)(microcarrier cell culture) 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)(hollow fibre cell culture) 微囊化細(xì)胞培養(yǎng),2細(xì)胞培養(yǎng)方法,懸浮培養(yǎng) 通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細(xì)胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法，主要用于一些在振蕩或攪拌下能生長繁殖的細(xì)胞，如生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 微載體培養(yǎng) 微載體直徑應(yīng)為60105nm，無毒性，透明，顆粒密度與培養(yǎng)液密度相近似，略重于液體，低速攪拌即能懸浮，不吸收培養(yǎng)液和化學(xué)反應(yīng)，表面光滑、硬度小、有彈性，易于細(xì)胞吸附在表面，如DEAESephadexA-50、Cytodexl、Cy

6、todex2、Cytodex3等。 微載體培養(yǎng)的容器為特制的生物反應(yīng)器，有自動化裝置。細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)106107個(gè)/m1，每升培養(yǎng)液可加微載體25g，每克有80009000個(gè)珠子，培養(yǎng)面積約為25萬cm2，比常規(guī)培養(yǎng)面積大1025倍。,中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)(hollow fibre cell culture) 組成:中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動泵 中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯丙烯復(fù)合物或多聚碳酸硅等材料制成，外徑50100m，壁厚2575m，壁呈海綿狀，上面有很多微孔。 中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入，而對細(xì)胞和大分子物質(zhì)（如單克隆抗體）有滯留作用。

7、 培養(yǎng)液能有效地分布，細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間可達(dá)數(shù)月，保持高度活性，培養(yǎng)的細(xì)胞密度大，細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)濃度高，純度可達(dá)6090；占用空間小，適于各類細(xì)胞，但設(shè)備昂貴。,培養(yǎng)液 血清 細(xì)胞接種量 pH 溫度 無菌條件 培養(yǎng)器皿清潔度,3. 細(xì)胞培養(yǎng)要素,RPMI-1640、199、 DMEM、F12,血清 成分：必需氨基酸、促進(jìn)細(xì)胞生長和貼壁的成分。-珠蛋白和白蛋白能促進(jìn)細(xì)胞生長；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、a2-球蛋白和脂蛋白G2能促進(jìn)細(xì)胞貼壁。 血清選擇：同種動物優(yōu)于異種動物血清；人和牛血清優(yōu)于馬血清；馬血清優(yōu)于兔血清和雞血清。 血清使用：目前國內(nèi)多用犢牛血清，使用前須經(jīng)56滅活30min，并進(jìn)行細(xì)

8、胞毒性試驗(yàn)。生長液血清含量一般為520。維持液中血清量為0%5。 血清替代因子：激素和生長因子（如胰島素、上皮生長因子）、結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）、貼壁因子（如魚精蛋白、聚賴氨酸）和微量元素（如硒）四類幾十種，多數(shù)無血清培養(yǎng)液須補(bǔ)加38種血清替代因子。,細(xì)胞接種量 細(xì)胞在生長過程中分泌刺激細(xì)胞分裂的物質(zhì)，若細(xì)胞量太少，這些物質(zhì)分泌量少，而作用也小。 接種細(xì)胞數(shù)量越大，細(xì)胞生長為單層的速度越快，但細(xì)胞過多對細(xì)胞生長也不利。 雞胚成纖維細(xì)胞為100萬m1 小鼠或地鼠腎細(xì)胞為50萬m1 猴腎細(xì)胞量為30萬ml 傳代細(xì)胞為1030萬m1,(1) 細(xì)菌污染 (2) 真菌污染：念珠菌或酵母菌。 培養(yǎng)液中可見

9、黃白色小點(diǎn)狀懸浮物 鏡檢時(shí)可見菌絲結(jié)構(gòu)。 (3) 支原體污染：污染率為5060 (4) 病毒污染 組織帶毒 培養(yǎng)液帶毒,4細(xì)胞培養(yǎng)污染問題,（1）血清 ：維持液內(nèi)犢牛血清含量一般不超過2。 （2）溫度：狂犬病病毒32，犬皰疹病毒36。 （3）pH： （4）病毒接種劑量：應(yīng)以TCID50為依據(jù) 一般按維持液的110(VV)量接入。 接種量小，細(xì)胞不能完全發(fā)生感染，會影響毒價(jià)； 接種量過大，會產(chǎn)生大量無感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接種方法：異步接毒和同步接毒。,5. 細(xì)胞培養(yǎng)病毒要素,6. 病毒增殖指標(biāo)與收獲 細(xì)胞病變(CPE)： 細(xì)胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等； 細(xì)胞聚合，如腺病毒； 細(xì)胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒； 輕微病變，如正粘病毒、冠狀病毒等。 包涵體和血凝性：也可作為檢查病毒增殖的指標(biāo)。 有些病毒不產(chǎn)生CP