1、體外診斷產(chǎn)品的生產(chǎn)監(jiān)管,北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所,1,主要內(nèi)容,體外診斷產(chǎn)品的種類(lèi) 體外診斷產(chǎn)品生產(chǎn)的基本原理 生化類(lèi)產(chǎn)品 免疫類(lèi)產(chǎn)品 分子類(lèi)和血液類(lèi) 溯源性問(wèn)題,體外診斷作用“醫(yī)生的眼睛”,預(yù)測(cè)和診斷功能，如： 血細(xì)胞 抗體（肝炎、艾滋、IGE） 基因（唐氏、小兒耳聾、遺傳缺陷基因BRCA1）。,療效和健康監(jiān)測(cè)，如： 代謝物（血糖） 標(biāo)志物（AFP、PSA、HPV） 蛋白、微量元素（白蛋白、Ca);,3,體外診斷產(chǎn)品的類(lèi)別,體外診斷根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分3類(lèi)： III類(lèi)：致病性病原體抗原、抗體以及核酸、人類(lèi)基因檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物、血型、組織配型、變態(tài)反應(yīng)（過(guò)敏原）等； II類(lèi)：除III、I類(lèi)，如：蛋白質(zhì)、糖類(lèi)

2、、酯類(lèi)、酶類(lèi)、維生素、無(wú)機(jī)離子、激素等； I類(lèi)：微生物培養(yǎng)基（不用于微生物鑒別和藥敏試驗(yàn)）、樣本處理用產(chǎn)品，如溶血?jiǎng)⑾♂屢?、染色液等?體外診斷產(chǎn)品的類(lèi)別,體外診斷專(zhuān)業(yè)分類(lèi):生化、免疫、分子生物學(xué)、微生物、體液等,臨床使用超過(guò)千種。 生化：生物化學(xué)反應(yīng)或免疫反應(yīng)(生化儀的項(xiàng)目），酶類(lèi)、糖類(lèi)、脂類(lèi)、蛋白、無(wú)機(jī)元素、肝功能、腎功等指標(biāo)。 免疫：抗原與抗體相結(jié)合的特異性反應(yīng)，傳染性疾病、內(nèi)分泌、腫瘤、藥物檢測(cè)、血型鑒定等。 分子診斷：分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化，主要用于肝炎、性病、優(yōu)生優(yōu)育、遺傳病基因、腫瘤等檢測(cè)。,體外診斷產(chǎn)品的類(lèi)別,微生物：通過(guò)培養(yǎng)鑒別細(xì)菌等微生物

3、的方法。 血液學(xué)：通過(guò)電阻抗、激光和高能電磁波等技術(shù)檢測(cè)血液中血細(xì)胞的數(shù)量和分類(lèi)的方法。,生化類(lèi)產(chǎn)品基本方法,生化分析儀反應(yīng)的一般稱(chēng)為生化試劑 兩點(diǎn)法、終點(diǎn)法、速率法、比濁法 兩點(diǎn)法： 測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始后某一時(shí)間內(nèi)(t1到t2)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量以求取酶反應(yīng)初速度的方法。 終點(diǎn)法： 通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始到反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)物或底物濃度總變化量，以求出酶活力的方法，亦稱(chēng)平衡法。 速率法： 是指連續(xù)測(cè)定(每15秒1分鐘監(jiān)測(cè)一次)酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或 底物的濃度隨時(shí)間的變化來(lái)求出酶反應(yīng)的初速度的方法，即連續(xù)監(jiān)測(cè)法。 透射比濁法透射比濁法可用于測(cè)定產(chǎn)生濁度反應(yīng)的項(xiàng)目。,生化類(lèi)產(chǎn)品基本方法,終點(diǎn)法

4、常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結(jié)合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測(cè)定法）、鈣（偶氮砷法）、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍(lán)法）。 兩點(diǎn)法：苦味酸法測(cè)定肌酐采用此法 速率法對(duì)于酶活性測(cè)定，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷氨氨酰基轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測(cè)定的項(xiàng)目如己糖激酶法測(cè)定葡萄糖、脲酶偶聯(lián)法測(cè)定尿素等，也可用連續(xù)監(jiān)測(cè)法。（7個(gè)酶加葡萄糖、尿素） 免疫

5、比濁法載脂蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體、抗“O”、類(lèi)風(fēng)濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。(蛋白）,生化類(lèi)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),生化分析儀說(shuō)明書(shū)除法規(guī)相關(guān)規(guī)定外，還至少包括： 適用機(jī)型 反應(yīng)溫度（37度） 主波長(zhǎng)、次波長(zhǎng) 孵育時(shí)間（終點(diǎn)法或兩點(diǎn)法） 延遲時(shí)間（連續(xù)監(jiān)測(cè)法）、連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間在延遲時(shí)間之后即開(kāi)始，一般為60120s不少于4個(gè)吸光度檢測(cè)點(diǎn)（3個(gè)吸光度變化值）； 加樣量 校準(zhǔn)液個(gè)數(shù)（非線(xiàn)性必須兩個(gè)以上）等。,標(biāo)準(zhǔn)液個(gè)數(shù)的原因,校準(zhǔn)液個(gè)數(shù)濃度校準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性好并通過(guò)坐標(biāo)零點(diǎn)的，可采用一個(gè)校準(zhǔn)液；線(xiàn)性好但不通過(guò)坐標(biāo)零點(diǎn)，應(yīng)使用兩個(gè)校準(zhǔn)液；對(duì)于校準(zhǔn)曲線(xiàn)呈非線(xiàn)性者，必須使用兩

6、個(gè)以上校準(zhǔn)液。每一個(gè)校準(zhǔn)液都要有一個(gè)合適的濃度。 吸光度,濃度,10,5,6000,3000,8,生化類(lèi)產(chǎn)品基本原理,氧化反應(yīng):,還原反應(yīng)：,生化類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)分析,原材料(輔酶I )（進(jìn)貨檢驗(yàn)記錄或生產(chǎn)記錄中，應(yīng)包括輔酶空白吸光度的檢驗(yàn)記錄，且不同的類(lèi)別符合下述特點(diǎn)） 還原性輔酶I主要用于下降反應(yīng)，當(dāng)還原性輔酶I質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，試劑的空白吸光度降低，導(dǎo)致試劑測(cè)量結(jié)果的不確定度變大，測(cè)量的靈敏度也隨之降低，測(cè)量線(xiàn)性范圍變小。 氧化性輔酶I主要用于上升反應(yīng)，當(dāng)氧化性輔酶I質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，試劑的空白吸光度升高，導(dǎo)致試劑測(cè)量結(jié)果的不確定度變大，測(cè)量的靈敏度也隨之降低，測(cè)量線(xiàn)性范圍變小。,生化類(lèi)產(chǎn)品

7、質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)分析,生產(chǎn)記錄中應(yīng)包括試劑用水的電導(dǎo)率、PH值及微生物檢驗(yàn)記錄,生化類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)分析,免疫類(lèi)產(chǎn)品基本原理,Elisa反應(yīng)的基本原理（酶標(biāo)儀、發(fā)光儀等） 將含有已知抗體的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗滌一次；加待測(cè)抗原，如兩者是特異的，則發(fā)生結(jié)合，然后把多余抗體洗除；加入與待測(cè)抗原呈特異反映的酶聯(lián)抗體（二抗），使形成“夾心”；加入該酶的底物，若看到有色的酶解產(chǎn)物產(chǎn)生，說(shuō)明在孔壁上存在相應(yīng)的抗原。,免疫類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)分析,辣根過(guò)氧化物酶 過(guò)氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱(chēng)辣根過(guò)氧化物酶（HRP），酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為27

8、5nm和403nm。 酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275 純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記。（檢查進(jìn)貨檢驗(yàn)記錄或生產(chǎn)過(guò)程記錄）,免疫產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)分析,酶與抗體的活性常用瓊脂擴(kuò)散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線(xiàn)，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時(shí)，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng)，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個(gè)測(cè)定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELI

9、SA方法進(jìn)行方陣滴定，此法不僅可以測(cè)定標(biāo)記效果，還可以確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。,免疫類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)分析,在產(chǎn)品進(jìn)貨檢驗(yàn)記錄或生產(chǎn)記錄中檢查以下內(nèi)容： 1、酶標(biāo)記二抗的活性； 2、用于ELISA的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時(shí)效果一般，為500(g/ml時(shí)效果較好，達(dá) 1000(g/ml時(shí)效果最好； 3、酶結(jié)合率為 7%時(shí)效果一般，為9%10%較好，達(dá)30%以上最好； 4、一抗進(jìn)貨檢驗(yàn)記錄，單抗還是多抗，也可小樣測(cè)試活性； 5、一抗包被的工藝記錄與質(zhì)量體系文件中要求是否一致； 5、儲(chǔ)存環(huán)境同生化產(chǎn)品；,分子類(lèi)產(chǎn)品基本原理,PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用DNA在體外攝氏95高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈

10、，低溫（經(jīng)常是60C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互補(bǔ)鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。,分子類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn),1、引物質(zhì)量，多為購(gòu)買(mǎi)，可做小樣，采購(gòu)記錄中查小樣測(cè)試記錄； 2、聚合酶質(zhì)量，多為購(gòu)買(mǎi)，可測(cè)定，可做小樣，采購(gòu)記錄中查小樣測(cè)試記錄； 3、內(nèi)標(biāo)：已知帶有引物片段樣本，與被測(cè)樣本同時(shí)擴(kuò)增，應(yīng)顯示陽(yáng)性，檢查測(cè)試記錄； 4、PCR生產(chǎn)企業(yè)控溫精度（95度、55度和75度）和變化率的記錄。 5、實(shí)地檢查PCR試劑的

11、質(zhì)控（內(nèi)標(biāo)）和生產(chǎn)是否在各自獨(dú)立的建筑中進(jìn)行。并且實(shí)驗(yàn)室分為試劑配制區(qū)、樣品處理區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。并且考慮房間的正負(fù)壓保護(hù)樣本不被污染、人員不被感染。,95度(高溫）,55度低溫,75度（反應(yīng)溫度）,95度,血液類(lèi)產(chǎn)品基本原理,懸浮在電解液中的顆粒/細(xì)胞，隨電解液通過(guò)小孔管時(shí)，因取代了相同體積的電解液，在恒電流設(shè)計(jì)的電路中導(dǎo)致小孔管內(nèi)外兩電極間電阻發(fā)生瞬時(shí)變化，而產(chǎn)生了電位脈沖。脈沖信號(hào)的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。,血液類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量控制點(diǎn),1、生產(chǎn)記錄中檢查溶血?jiǎng)?、稀釋液的顆粒物、微生物檢驗(yàn)記錄； 2、血細(xì)胞分析儀稀釋液生產(chǎn)車(chē)間需控制潔凈度和菌落數(shù)； 3、檢驗(yàn)室的血液分析儀是

12、否采用定值血定期校準(zhǔn)； 4、檢驗(yàn)室的血液分析儀內(nèi)部質(zhì)控結(jié)果，紅白偏差是否符合要求（特別是血小板）。,體外診斷試劑溯源,校準(zhǔn)液個(gè)數(shù)濃度校準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性好并通過(guò)坐標(biāo)零點(diǎn)的，可采用一個(gè)校準(zhǔn)液；線(xiàn)性好但不通過(guò)坐標(biāo)零點(diǎn)，應(yīng)使用兩個(gè)校準(zhǔn)液；對(duì)于校準(zhǔn)曲線(xiàn)呈非線(xiàn)性者，必須使用兩個(gè)以上校準(zhǔn)液。每一個(gè)校準(zhǔn)液都要有一個(gè)合適的濃度。 吸光度,濃度,10,5,6000,3000,8,2009年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局體外診斷試劑監(jiān)督抽驗(yàn) 61個(gè)國(guó)產(chǎn)TG試劑,新鮮混合血清 最大正偏倚為22.1，最大負(fù)偏倚為-18.9，39% bias 5,體外診斷試劑溯源,校準(zhǔn)品與質(zhì)控品區(qū)別 校準(zhǔn)品目的是為了產(chǎn)品的準(zhǔn)確性，溯源性是必須的； 質(zhì)

13、控品目的是為了產(chǎn)品的精密度，穩(wěn)定性是必須的，可不具備溯源性。,溯源性有多重要？ 臨床檢驗(yàn)：對(duì)收集的患者標(biāo)本只做一次檢驗(yàn)，就發(fā)出報(bào)告 準(zhǔn)確性不足是重要的臨床檢驗(yàn)質(zhì)量問(wèn)題 影響檢驗(yàn)結(jié)果“臨床準(zhǔn)確性”的因素是多方面的 樣品采集與處理，病人準(zhǔn)備，(生物變異)，人為錯(cuò)誤 方法：正確度（校準(zhǔn)）、精密度、特異性、線(xiàn)性、檢測(cè)限等 溯源理論上解決的是正確度問(wèn)題(校準(zhǔn)問(wèn)題),體外診斷試劑溯源,體外診斷試劑溯源,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),制造商選定方法,主校準(zhǔn)品,制造商常設(shè)方法,產(chǎn)品校準(zhǔn)品,常規(guī)方法,血樣,體外診斷試劑溯源,1、有溯源性才能判斷準(zhǔn)確性； 2、檢驗(yàn)結(jié)果才能互認(rèn)； 目前問(wèn)題 1、CRM缺乏； 2、反應(yīng)原理差異，導(dǎo)致結(jié)果有差異，但Cutoff值也不同，不影響臨床判斷，結(jié)果無(wú)法互認(rèn)； 3、各自溯源路徑不同，結(jié)果存在差異。,體外診斷試劑溯源,目前采用的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)方法 1.國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（有溯源性）（查驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證明材料，一般為證書(shū)） 2.回收實(shí)驗(yàn)（有一定溯源性）（添加物質(zhì)純度，實(shí)驗(yàn)記錄） 3. 與大公