1、核酸血液篩查,August 23, 2020,P1,目 錄,P2,核酸血液篩查系統(tǒng),August 23, 2020,血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存,PCR實驗室的污染防治,分子生物學(xué)概論,P3,August 23, 2020,核酸的分子組成-核苷酸,分子生物學(xué)概論,P4,August 23, 2020,DNA的一級結(jié)構(gòu),Cytosine,Adenine,Thymine,Guanine,Hydrogen Bonds,Deoxyribose (Sugar molecule),Phosphoric Acid (Phosphate molecule),由A/T/G/C四種單核苷酸組成,分子生物學(xué)概

2、論,DNA的二級結(jié)構(gòu),P5,August 23, 2020,DNA分子由相互平行、走向相反、堿基互補的兩條脫氧核糖核苷酸鏈圍繞同一中心軸，盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋的一側(cè)為大溝，另一側(cè)為小溝。平行鏈對應(yīng)堿基總是A=T、G = C配對（base pairing)或互補，形成穩(wěn)定聯(lián)系。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),P6,August 23, 2020,分子生物學(xué)概論,核酸的理化性質(zhì),DNA的熱變性與復(fù)性,DNA熱變性后緩慢冷卻處理過程稱退火 annealing DNA加熱變性后，若經(jīng)驟然降溫，互補鏈堿基之間來不及配對互補，形成氫鍵聯(lián)系，兩鏈維持分離狀態(tài)。,分子生物學(xué)概論,P7,August 23, 2020,核

3、酸分子雜交 hybridization,當(dāng)不同來源的核酸變性后一起復(fù)性時，只要這些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成堿基配對，出現(xiàn)復(fù)性現(xiàn)象，形成雜種核酸分子，或稱雜化雙鏈，稱核酸分子雜交。,分子生物學(xué)概論,P8,August 23, 2020,DNA半保留復(fù)制,DNA合成進行時，以兩條親代DNA鏈中的每條鏈為模板，在DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶催化下，按A與T、G與C堿基配對原則合成子代DNA的過程稱DNA的復(fù)制(replication)。由于復(fù)制合成的子代DNA兩條脫氧核糖核苷酸鏈中有一條來自親代DNA，另一條是以前者為模板新合成的子代DNA鏈，所以DNA的這種合成作用又稱半保留復(fù)制(se

4、miconservative replication)。,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P9,August 23, 2020,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),磁珠法提取核酸,熒光PCR技術(shù)與TMA技術(shù),UNG-dUTP防污染系統(tǒng),內(nèi)對照分子,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P10,August 23, 2020,磁珠法提取核酸,樣品核酸提取 磁珠法,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P11,August 23, 2020,磁珠法提取核酸,第一步：細胞的裂解：破碎細胞，并向溶液中加入磁珠。,第二步：結(jié)合核酸：pH較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P12,August 23, 2

5、020,磁珠法提取核酸,第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離（為清洗干凈該步驟可以重復(fù)多次）。,第四步：核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來。,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P13,August 23, 2020,PCR技術(shù),d.NTPs,耐熱DNA聚合酶,引物,加入試管中,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P14,August 23, 2020,PCR技術(shù),循環(huán),循環(huán),延伸,繼續(xù)延伸,循環(huán),核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P15,August 23, 2020,PCR技術(shù),第二個循環(huán) 4個拷貝,第三個循環(huán) 8個拷貝,第n個循環(huán) 2n個拷貝,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P16,August 23, 2020,

6、PCR技術(shù),分子生物學(xué)概論,P17,August 23, 2020,TMA技術(shù),核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P18,August 23, 2020,TMA與PCR比較,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P19,August 23, 2020,熒光PCR技術(shù),SYBR GREEN,Molecularbeacon,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P20,August 23, 2020,TaqMan熒光PCR技術(shù),核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P21,August 23, 2020,TaqMan熒光PCR技術(shù),d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and

7、 Sample,Denaturation,Annealing,Reaction Tube,l,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P22,August 23, 2020,TaqMan熒光PCR技術(shù),Extension Step,1. Strand Displacement,2. Cleavage,3. Polymerization Complete,4. Detection,l,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P23,August 23, 2020,熒光定量PCR技術(shù),一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段 , 熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P24,August 23

8、, 2020,CT值與閾值,CT值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P25,August 23, 2020,CT值與閾值,實驗操作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時所對應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)（圖）?！盎€上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號強度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴增曲線的交點所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值。,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P26,August 23, 2020,熒光定量PCR檢測流程圖,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P27,August 23, 2020,UN

9、G-dUTP防污染系統(tǒng),UNG：Uracil-DNA Glycosylase，也稱為UDG，尿嘧啶糖基化酶,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P28,August 23, 2020,UNG生化特性,1,2,3,4,無作用： 游離U、A、 T、G、C和 RNA,不耐熱： 37-50 95,分子量小球蛋白 發(fā)揮作用不依賴于Mg2+,作用范圍： 單鏈和雙鏈 U堿基 糖苷鍵,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P29,August 23, 2020,dUTP-UNG系統(tǒng)實施的必要性,產(chǎn)物污染 交叉污染 試劑污染 天然核酸 的污染,實驗室污染,物理分區(qū) 紫外線照射 高壓消毒 10%次氯酸鈉 DNase I消化 UNG消化,核酸血

10、液篩查相關(guān)技術(shù),P30,August 23, 2020,dUTP-UNG作用原理,特異地識別DNA分子中尿嘧啶核苷,切割下來，形成自由的尿嘧啶和 “糖-磷酸”骨架,加熱或堿性條件下， DNA在“糖-磷酸骨架”處斷裂,模板無法擴增,dUTP代替dTTP擴增，形成UNG 有效作用底物U-DNA,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P31,August 23, 2020,dUTP-UNG作用示意圖,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P32,August 23, 2020,dUTP-UNG優(yōu)缺點,缺點,優(yōu)點,Text,Text,防止含dU產(chǎn)物的污染 不影響目的片段的擴增 作用條件簡單，易實現(xiàn)。,只防自身產(chǎn)物的污染，不防天然產(chǎn)物

11、的污染。 若混有核酸酶，會同時分解目的產(chǎn)物。 UNG致使CT值增加，易導(dǎo)致假陰性。 dUTP在對GC豐富的模板時作用不大。 滅活不夠完全。 相對用dTTP，成本高。,VS,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P33,August 23, 2020,內(nèi)對照分子,Text,Text,內(nèi)參照的概念 人工合成的小片段DNA，放在反應(yīng)液中和待測目的基因一起擴增。 內(nèi)對照是PCR方法檢測疾病基因的必需成分，是防止假陰性、提高檢測結(jié)果可靠性的重要標(biāo)示。 內(nèi)對照對整個實驗流程，包括樣品提取、分裝、PCR熱循環(huán)儀孔間差、PCR抑制元素等等可能的影響因素進行監(jiān)控，防止假陰性，提高安全性,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P34,Augus

12、t 23, 2020,競爭性內(nèi)對照分子,3,5,5,3,3,5,1,20,291,310 (BP),兩端為特異性引物,目的基因片段,內(nèi)對照順序,競爭性內(nèi)對照的概念 與目的基因使用相同的引物。 擴增產(chǎn)物序列與目的基因不同，可用不同的探針檢測。,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P35,August 23, 2020,競爭性內(nèi)對照分子,3,5,5,3,3,5,1,20,291,310 (BP),內(nèi)對照特異性引物,目的基因片段,內(nèi)對照順序,非競爭性內(nèi)對照的概念 與目的基因使用不同的引物。 擴增產(chǎn)物序列與目的基因不同，可用不同的探針檢測。,目的基因特異性引物,核酸血液篩查相關(guān)技術(shù),P36,August 23, 2

13、020,內(nèi)對照分子,內(nèi)對照的作用 真實反應(yīng)擴增效率 避免假陰性：假陰性是目前血液篩查中最重視的問題之一，內(nèi)標(biāo)全程進行質(zhì)量監(jiān)控質(zhì)控,血篩核酸檢測的內(nèi)對照設(shè)計理念 中心理念：監(jiān)測全程的實驗過程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、及擴增過程的效率。 內(nèi)對照選用：最好能達到上述三個條件，且能顧及仿真病毒的安全性。,核酸血液篩查系統(tǒng),P37,August 23, 2020,核酸血液篩查系統(tǒng),核酸檢測樣本匯集設(shè)備,自動化核酸提取設(shè)備,PCR擴增和擴增產(chǎn)物的檢測設(shè)備,核酸血液篩查系統(tǒng),P38,August 23, 2020,核酸血液篩查系統(tǒng),分析后,采集容器 采集方式 保存運輸 不合格樣本： 脂血、溶血、樣本量不足,

14、樣本,分析中,分析前,檢測結(jié)果,純化試劑 準(zhǔn)備,儀器 維護 自檢,準(zhǔn)備： 質(zhì)控 樣本 試劑,前處理 混樣 信息錄入,擴增檢測,核酸純化,檢測系統(tǒng),試劑 設(shè)備 質(zhì)控品,檢測試劑的準(zhǔn)備,核酸血液篩查系統(tǒng),P39,August 23, 2020,核酸檢測樣本匯集設(shè)備,加樣器,HAMILTON 液體工作站,核酸血液篩查系統(tǒng),P40,August 23, 2020,自動化核酸提取設(shè)備,自動化核酸提取(EZbead system-32),核酸血液篩查系統(tǒng),P41,August 23, 2020,PCR擴增和擴增產(chǎn)物的檢測設(shè)備,ABI7500實時熒光定量PCR儀,血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存,P42,

15、August 23, 2020,血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存,樣本的采集,樣本的運送,樣本的接收與保存,血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存,P43,August 23, 2020,關(guān)注采集、保存、運輸?shù)募毠?jié),運輸條件,離心,采血管,P44,August 23, 2020,標(biāo)本的采集-采血管,無菌真空采血管 一、血清管 普通血清管 帶分離膠的血清管 二、抗凝管 EDTA 2K或3K抗凝管 EDTA 2K抗凝間分離膠（PPT) 枸櫞酸鈉抗凝管,血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存,P45,August 23, 2020,標(biāo)本的采集-離心,離心條件 800-1600g 20min 離心分離的時間

16、要求HCV RNA 和HIV RNA 研究方式不同（樣本、檢測）結(jié)論差異大 離心時間 完成地點,血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存,P46,August 23, 2020,標(biāo)本的運送,2-8C穩(wěn)定48hr,血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存,P47,August 23, 2020,標(biāo)本的接收、保存,確認標(biāo)本數(shù)量 運輸狀態(tài) 標(biāo)本狀態(tài)：溶血、脂血 保存： 用于檢測的樣本管：檢測前保存 用于留樣備查的樣本：樣本量,血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存,P48,August 23, 2020,檢測前核對,狀態(tài) 標(biāo)識 接收時間 離心后至檢測前2-8C保存不超過48小時,血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存,

17、P49,August 23, 2020,長期留樣樣本,理論上-80 C 保存量：核酸檢測樣本量比酶免確認實驗大 長期保存：保存管密閉程度,血站核酸檢測樣本的采集、運送和保存,PCR實驗室污染防治,P50,August 23, 2020,PCR實驗室污染防治,PCR實驗室的分區(qū),實驗室人員基本要求,PCR實驗室管理,核酸擴增儀器設(shè)備的質(zhì)控,PCR實驗室污染防治,P51,August 23, 2020,PCR實驗室的分區(qū),一個基本符合要求的PCR實驗室應(yīng)包括34個區(qū) 試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū) 各區(qū)在物理空間上完全互相獨立，使用功能上互相分割 各區(qū)之間不能有空氣直接相通 各區(qū)使用的

18、儀器設(shè)備、移液器、Tip、試管架、筆記本、記號筆、手套等包括清潔用物品都必需執(zhí)行專區(qū)專用原則。,PCR實驗室的污染防治,P52,August 23, 2020,理想的核酸擴增實驗室設(shè)計A,PCR實驗室的污染防治,P53,August 23, 2020,理想的核酸擴增實驗室設(shè)計B,PCR實驗室的污染防治,P54,August 23, 2020,核酸擴增檢測實驗室設(shè)計的一般原則,各區(qū)獨立 注意風(fēng)向 因地制宜 方便工作,“十六字口訣”,PCR實驗室的污染防治,P55,August 23, 2020,核酸擴增實驗室的工作流程,試劑準(zhǔn)備區(qū),標(biāo)本制備區(qū),擴增區(qū)及擴增產(chǎn)物分析區(qū),PCR實驗室的污染防治,P56,August 23, 2020,實驗室人員基本要求,進入實驗室人員要按規(guī)定穿工作服 進行各項檢驗的人員禁止佩戴項鏈、首飾等物品 實驗室內(nèi)禁止大聲喧嘩 實驗過程中禁止講話，必需講話時應(yīng)在實驗允許暫定的某個點暫停實驗，回答必需回答的問題,PCR實驗室的污染防治,P57,August 23, 2020,PCR實驗室管理,共同維護實驗室環(huán)境衛(wèi)生 實驗用物品擺放整齊、規(guī)范 移液器-及時清潔、定期校驗、使用后歸放原處 Tip盒 - 打開Tip盒的盒蓋應(yīng)朝上放置，用完后隨手蓋上。 Tip盒內(nèi)要定期清潔 Tip的使用-實驗用Tip有散裝和