1、第 四 章,基因工程,(genetic engineering),第 一 節(jié),基 因 工 程的基本知識,一、基本概念,DNA重組(DNA recombination ）：,不同來源的DNA分子可以通過磷酸二酯鍵連接形成重新組合的DNA分子，稱為DNA重組 。,基因工程(genetic engineering) ：,將基因進(jìn)行克隆，并利用克隆的基因表達(dá)、制備特定的蛋白或多肽產(chǎn)物，或定向改造細(xì)胞乃至生物個體的特性所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為基因工程 。,二、工具酶,（一）限制性核酸內(nèi)切酶,1.限制性核酸內(nèi)切酶的概念,能夠切割DNA多聚核苷酸鏈中磷酸二酯鍵的酶稱為核酸酶，其中有選擇地切割DNA分子特

2、異序列的核酸酶，稱為限制性核酸內(nèi)切酶，簡稱限制性內(nèi)切酶 。,2.限制性核酸內(nèi)切酶的識別和切割位點(diǎn),大部分限制性核酸內(nèi)切酶識別的DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征，通常是46堿基對，大多數(shù)酶是錯位切割雙鏈DNA，產(chǎn)生5磷酸基和3羥基末端。,3種不同的情況：,（1）產(chǎn)生5突出粘性末端：,（2）產(chǎn)生3突出粘性末端：,（3）產(chǎn)生平末端：,（二）其它工具酶,1.DNA連接酶 （DNA ligase)： 雙鏈中一條完整的單鏈可作模板，另一條單鏈中的切口位點(diǎn)不缺少任何核苷酸，切口有相鄰的5-磷酸和3-羥基末端，使單鏈切口形成磷酸二酯健，共價連接,2.DNA聚合酶 ： 用途： （1）合成cDNA第二條鏈 （2）對DN

3、A 3端進(jìn)行填補(bǔ)和末端標(biāo)記 （3）Taq酶聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等,3.逆轉(zhuǎn)錄酶 ： 依賴于RNA的DNA聚合酶 mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,4.堿性磷酸酶 ： 特異性切除DNA或RNA5端的磷酸基，防止載體的自身連接,5.多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，能催化ATP的-磷酸基轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5羥基上 （1）放射性標(biāo)記5端 （2）用于連接反應(yīng),6.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 小牛胸腺中分離，催化單核苷酸轉(zhuǎn)移到DNA的3端羥基上,三、載體,載體的一般要求：,能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖，并有較高的拷貝數(shù)；,容易進(jìn)入宿主細(xì)胞；,容易從宿主細(xì)胞中分離純化；,有容易被識別篩選的標(biāo)志,

4、具有多個限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)， 即為多克隆位點(diǎn)；,（一）質(zhì)粒 (plasmid),質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌中存在的獨(dú)立于染色質(zhì)以外的、能自主復(fù)制的、并與細(xì)菌或細(xì)胞共存的遺傳成分。多為雙鏈共價閉合環(huán)形DNA。,如pBR322質(zhì)粒：,長度為4.3kb，含有氨芐青霉素（ampr）、卡那霉素（kanr）和四環(huán)素（tetr）的抗性基因,AmpR_promoter2556-2528 lac_promoter543 514 M13_pUC_rev_primer500 478 pBR322_origin147-1852 M13_reverse_primer479 461 M13_forward20_

5、primer379 395 M13_pUC_fwd_primer364 386 lacZ_a393 250 Ampicillin2486 - 1626,(二)噬菌體 (bacteriophage，phage),噬菌體是感染細(xì)菌的一類病毒，因其寄生在細(xì)菌中并能溶解細(xì)菌細(xì)胞，所以稱為噬菌體。,噬菌體,噬菌體兩端各有12個堿基互補(bǔ)的單鏈末端（cos末端） 噬菌體進(jìn)大腸桿菌后兩端的cos末端環(huán)化成雙鏈雙 鏈以兩種不同的形式繁殖 1.溶菌性方式，連續(xù)增殖，直到細(xì)菌裂解，釋放出的 噬菌體又去感染其他細(xì)菌 2.溶原性方式：將自身的DNA整合到細(xì)菌染色體中， 和細(xì)菌染色體一起復(fù)制,噬菌體優(yōu)點(diǎn)： 1.是一種溫和

6、的噬菌體，他對大腸桿菌具有很高的感染能力 2.能承載較大的外源DNA片斷，噬菌體上有約20kb區(qū)域?qū)τ谑删w的生長不是絕對需要，可以缺失或被外源DNA片斷取代 3. 噬菌體上有許多限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，適合于多種外源DNA酶切片斷克隆,構(gòu)建噬菌體載體思路 1.使用限制性酶切去噬菌體上的非必需區(qū)，確定一種限制酶識別序列作用克隆點(diǎn)，刪除這種酶在DNA上的多余識別序列 2. DNA的非必需區(qū)引入選擇性標(biāo)記基因 3.建立重組DNA分子體后包裝系統(tǒng)成為有活性的噬菌體顆粒,(三)粘粒（cosmid）,粘粒（cosmid）是將噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒組合的裝配型載體。,質(zhì)粒提供了復(fù)制的起始點(diǎn)、酶切位點(diǎn)、抗生素

7、抗性基因， 而cos區(qū)提供了粘粒重組外源DNA大片段后的包裝基礎(chǔ)。,動物病毒含有能夠被真核細(xì)胞識別的有效的啟動子。 有許多種動物病毒，在其感染周期中都能夠持續(xù)地復(fù)制，使其基因組拷貝數(shù)達(dá)到相當(dāng)高的水平。 有些動物病毒具有控制自己復(fù)制的順式元件和反式作用因子。,（四）、病毒,有些動物病毒，在它們的復(fù)制過程中能高效穩(wěn)定地整合到寄主核基因組上。 病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識別細(xì)胞接受器(acceptor)。用病毒外殼蛋白質(zhì)包裝重組質(zhì)粒DNA形成的假病毒顆粒(pseudovirions)，即構(gòu)成了一種高效的轉(zhuǎn)化體系。,包裝細(xì)胞 為了使重組病毒DNA分子包裝成病毒顆粒，使其成為一個有感染力的重組病毒顆粒，需要構(gòu)

8、建一個病毒包裝細(xì)胞，又稱為輔助細(xì)胞。 在包裝細(xì)胞內(nèi)，染色體中整合了除序列的整個輔助病毒基因組，由于缺乏序列，病毒蛋白不能包裝成病毒顆粒，但它能為重組病毒載體轉(zhuǎn)錄的RNA提供包裝蛋白,四、重組DNA技術(shù)的基本過程,重組DNA技術(shù)的基本步驟：,制備目的基因和相關(guān)載體； 將目的基因和載體進(jìn)行連接； 將重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞； DNA重組體的篩選和鑒定； DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其它研究。,1.目的基因的制備,（1）基因組DNA文庫 采用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切成片段，每一DNA片斷都與一個載體分子拼接成重組DNA。將所有重組DNA都引入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這個混合體稱為基

9、因文庫。完成DNA重組后可通過雜交篩選獲得特定的基因片斷,1.目的基因的制備,（2）cDNA文庫 以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，將cDNA的混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個cDNA分子都與一個載體分子拼接成重組DNA。將所有的重組DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這個混合體就叫做cDNA文庫 可通過雜交篩選獲得特定的cDNA克隆。,1.目的基因的制備,（3）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 已經(jīng)知道目的基因的序列，可以用PCR從基因組DNA 中獲得目的基因，也可以采用RT-PCR技術(shù)直接從mRNA獲得基因的cDNA,1.目的基因的制備,（4）化學(xué)合成 知道肽鏈的氨基酸順序，

10、按照對應(yīng)密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基序列，然后利用化學(xué)方法合成,2.目的基因與載體的連接,（1）黏性末端的連接 （2）同聚物加尾連接：末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 （3）平末端連接：效率比黏末端連接低很多 （4）人工接頭連接,第 二 節(jié),聚合酶鏈反應(yīng) PCR,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。,由高溫變性，低溫退火和適溫延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,1、變性（94） ： 使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離成單鏈DNA 2、退火（55）： 引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈 3、延伸（72）：,通過Taq

11、DNA聚合酶使4種單核苷酸從引物的3端開始摻入，沿模板從5向3端方向延伸，合成與模板DNA的互補(bǔ)鏈。,以上3步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一個循環(huán)的模板，反復(fù)進(jìn)行這一循環(huán)，可使兩端引物限定范圍內(nèi)的DNA序列以指數(shù)形式擴(kuò)增，循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板的濃度，從理論上講一個目的DNA分子經(jīng)20次循環(huán)擴(kuò)增后可達(dá)106。,雙鏈DNA分子,雙鏈斷開,循環(huán)1,模板與引物結(jié)合,循環(huán)1,Taq,Taq,循環(huán)1,Taq,Taq,循環(huán)1,循環(huán)1,雙鏈斷開,循環(huán)2,模板與引物結(jié)合,循環(huán)2,Taq,Taq,Taq,Taq,循環(huán)2,94變性 雙鏈斷開,循環(huán)3,循環(huán)3,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,循環(huán)3