1、實驗三細胞的傳代培養(yǎng)及凍存,實驗目的,1.掌握細胞傳代培養(yǎng)的方法 2.掌握細胞凍存的方法 3.建立嚴格的無菌操作觀念,實驗原理,傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一，也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎。 當細胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續(xù)生長，這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細胞供實驗所需。 傳代要在嚴格的無菌條件下進行。,實驗原理,利用凍存技術將細胞置于-196液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗，起到了細胞保種的作用。還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。 細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入

2、保護劑-終濃度5%-15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結條件下，細胞內水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。 采用慢凍快融的方法能較好地保證細胞存活。標準冷凍速度開始為-1 到 -2/min，當溫度低于-25時可加速，到-80之后可直接投入液氮內(-196)。,低溫保護劑,細胞直接凍存會導致細胞死亡。必須加低溫保護劑。 常用：二甲亞砜（DMSO）。是一種滲透性保護劑。 機理：可迅速透入性別，降低冰點，提高細胞膜對水的通透性，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，提高細胞內的電解質濃度，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞凍傷。 濃度

3、：510%，細胞凍存12年，存活率 8090%。 二甲亞砜有一定的毒副作用，能引起蛋白質變性。解凍后，細胞出現凝集現象。用于病人可出現心律失常、高血壓等癥狀。 目前，造血干細胞凍存時，采用5DMSO+6%HES（羥乙基淀粉）兩種冷凍保護劑。,實驗材料,癌細胞 ； 10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液；消化液（0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液）；D-Hanks液；凍存液 細胞培養(yǎng)皿；離心管 ；凍存管；微量移液器 75酒精棉球；酒精燈1臺；廢液缸 液氮；二氧化碳 顯微鏡；細胞培養(yǎng)箱,NCI-H460 SPCA1 KYSE30 KYSE510,操作步驟,棄去細胞瓶中的原有培養(yǎng)液。 加入適量D-H

4、anks液(1mL)，輕輕搖動，洗去老化的細胞及殘留的培養(yǎng)液。重復兩次。 加入適量消化液(1mL) ，輕輕搖晃至平鋪細胞瓶底層，37靜置2 min，直至細胞層發(fā)白、卷邊、有間隙，即將脫落，加入3mL營養(yǎng)液終止消化。 用吸管反復均勻吹打瓶壁，使細胞脫落，并形成單個細胞狀態(tài)向細胞沉淀中再加入6ml的營養(yǎng)液制成細胞懸液，分別加入新的細胞培養(yǎng)瓶中（5mL/瓶），擰好瓶蓋，放入培養(yǎng)箱中。37培養(yǎng)24h后觀察結果。,操作步驟,棄去細胞瓶中的原有培養(yǎng)液。 加入適量D-Hanks液(1mL)，輕輕搖動，洗去老化的細胞及殘留的培養(yǎng)液。重復兩次。 加入適量消化液(1mL) ，輕輕搖晃至平鋪細胞瓶底層，37靜置2

5、min，直至細胞層發(fā)白、卷邊、有間隙，即將脫落，加入3mL營養(yǎng)液終止消化。 用吸管反復均勻吹打瓶壁，使細胞脫落，并形成單個細胞狀態(tài)。轉移到離心管中，1500r/min,離心5min。 棄去上清，細胞沉淀中再加入0.9ml的營養(yǎng)液制成細胞懸液，轉移入凍存管，再向凍存管中加入0.9ml凍存液,擰好瓶蓋，放入4冰箱中1h,-20冰箱中1h,-80冰箱中過夜，轉移至液氮中。,實驗結果,1、觀察細胞形態(tài) 2、注意是否污染 3、凍存細胞,注意事項,操作前要洗手，進入超凈臺后手用75%的酒精擦拭。試劑等瓶口也要擦拭或灼燒。 所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。 吸過營養(yǎng)液的用具不能再灼燒，以免燒焦形成碳膜。 不能用手接觸已消毒器皿的工作部分。 吸溶液的吸管不能混用。,傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作并防止細胞之間的交叉污染。每次最好只進行一種細胞的操作。每一種細胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應嚴格分開。 每天觀察細胞形態(tài)，掌握好細胞是否健康的標準：健康細胞的形態(tài)飽滿，折光性好，平鋪細胞瓶底層，生長致密時即可繼續(xù)傳代。,實驗報告,實驗三、細胞的傳代培養(yǎng)及