1、SSR分析的原理及操作技術,1,DNA分子標記技術類型,以Southern雜交為基礎的分子標記技術： 限制性內切酶片段長度多態(tài)性標記（RFLP） 以PCR為基礎的分子標記技術：隨機引物PCR標記和特異引物PCR標記 隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD） 擴增的限制性內切酶片段長度多態(tài)性（AFLP） 相關序列擴增多態(tài)性（SRAP） 簡單重復序列（SSR）或簡單序列長度多態(tài)性（SSLP） 以mRNA為基礎的分子標記技術： 差異顯示（DD） 逆轉錄PCR（RTPCR） 以單核苷酸多態(tài)性為基礎的分子標記技術： 單核苷酸多態(tài)性（SNP）,2,SSR簡介,在生物的基因組中，特別是高等生物的基因組中含有大量的重

2、復序列， 根據(jù)重復序列在基因組中的分布形式可分為： 串聯(lián)重復序列（Tandemly repeated sequences） 分散重復序列（Interspersed repeated sequences） 依據(jù)重復基序的長度、拷貝數(shù)和位置等又將串聯(lián) 重復序列分為： 衛(wèi)星DNA：基序（motif）長10300bp，甚至長1,000100,000bp； 小衛(wèi)星DNA：基序長1060bp； 微衛(wèi)星DNA：基序長16bp，其功能：重組熱點、對基因的調節(jié)和表達以及性別決定等。,3,SSR簡介,微衛(wèi)星DNA即簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）， 或者微衛(wèi)星序列（micros

3、atellite，MS）， 又稱短串聯(lián)重復（short tandem repeats，STR）， 是一類由幾個核苷酸（多為24個）為基本單位多次串聯(lián)重復而形成的DNA片段，其長度一般較短，多在200bp以內。 微衛(wèi)星在植物基因組中的含量非常豐富，均勻分布于整個植物基因組中，但不同植物中微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率變化非常大，但（AT）n最多。,4,SSR標記的基本原理,盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組中的不同位置，但某一特定的微衛(wèi)星的兩端側翼序列通常都是保守性較強的單一序列，將重復序列及其兩側的DNA片段進行克隆和測序，然后根據(jù)兩端的側翼序列設計一對特異引物，通過PCR技術將目的微衛(wèi)星DNA片段擴增出來。

4、,5,SSR標記的基本原理,由于單個微衛(wèi)星位點的重復單元在數(shù)量上的不同，導致擴增產(chǎn)物在長度上發(fā)生變化，即產(chǎn)生長度多態(tài)性，這種多態(tài)性稱為簡單序列長度多態(tài)性(simple sequence length polymorphism，SSLP)，每一擴增位點就代表了該位點的一對等位基因。 SSR標記的多態(tài)性主要依賴于基本單位重復次數(shù)的變異，而這種變異在生物群體中是大量存在的，因此，SSR具有大量的等位差異，多態(tài)性十分豐富。,6,7,8,PCR技術的基本原理,聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是利用單鏈寡核苷酸引物對特異DNA片段進行體外快速擴增的一種方法。 特

5、點一：使特定的DNA片段得到了迅速大量的擴增，理論上的最高值達2n-2； 特點二：能夠指導特定DNA片段的合成。 如何實現(xiàn)？,9,10,11,PCR反應體系,一對特異引物： 1.引物長度：典型的引物長度為18-24bp，引物需要足夠長，保證序列獨特性。但是長度大于24bp的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量； 2.引物濃度：一般0.1-0.5 mol/L，過高的引物濃度會加劇錯配發(fā)生，特異性下降； 3.合理的G/C含量：一般為4060。,12,PCR反應體系,Mg2溶液 ：其濃度直接影響引物退火的特異性、產(chǎn)物特異性以

6、及酶的催化能力和準確性等，適當降低Mg2濃度可增加特異性。 模板DNA：一般1ng/1L，模板濃度過高會導致反應的非特異性增加； dNTP ：常用濃度為50-200mol/L，種dNTP濃度應相等，濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產(chǎn)量。 Taq酶 ：DNA聚合酶，熱穩(wěn)定，最適溫度72 ，酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產(chǎn)量。 10buffer緩沖液（不含Mg2 ）：維持PCR pH的穩(wěn)定。,13,PCR循環(huán)條件,高溫變性：雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈； 低溫退火：在低溫下引物與單鏈DNA互補配對； 退火溫度針對不同的引物差別較大，退火溫度過低，極易形成非特異擴增，而退

7、火溫度過高，又難以擴增出條帶，對于長度為20bp，GC含量為50的核苷酸的典型引物，55 是比較適宜的退火溫度。 適溫延伸：在適宜溫度下Taq DNA酶催化引物沿著模板DNA延伸。,14,PCR條件優(yōu)化,優(yōu)化引物設計：這是最關鍵的，可以借助計算機來輔助設計引物。 熱啟動技術：在PCR反應的第一個循環(huán)中待溫度升高且超過模板Tm值（80）后，再加入關鍵試劑如Taq DNA聚合酶等。這樣操作可以減少非特異性擴增。 創(chuàng)造一個有利于增加特異性擴增的條件：如降低Mg2，dNTP濃度，優(yōu)化pH及減少Taq酶的用量，減少循環(huán)中各部分的時間或循環(huán)數(shù)，提高退火溫度等。,15,電泳原理,在生理條件下，核酸分子之糖磷

8、酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的。當核酸分子被放置在電場中時，他們就會向正電極的方向遷移。 在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子，具有較緊密的構型，所以其電泳遷移率較快。,16,電泳介質,瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 優(yōu)點： 分辨率極高，可分開長度僅相差0.1的DNA分子，即 1000bp中相差1bp； 從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高，可用于要求最高的實驗。,17,聚丙烯酰胺凝膠,聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N,N,N,N一四甲基乙二胺)和過硫酸銨的作用

9、下，聚合形成線狀長鏈，在交聯(lián)劑如N,N-甲叉雙丙烯酰胺參與下的共聚合反應中，聚丙烯胺的鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成三維帶狀網(wǎng)絡結構的凝膠。 這些網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。,18,19,聚丙烯酰胺凝膠,變性聚丙烯酰胺凝膠 用于單鏈DNA片斷的分離與純化。這些凝膠在尿素或甲酰胺等抑制核酸堿基配對的試劑的存在下發(fā)生聚合。變性的DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關。 非變性聚丙烯酰胺凝膠 用于雙鏈DNA片段的分離和純化。雙鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率通常與其大小的常用對數(shù)值成反比。然而，電泳遷移率也受其堿基組成和序列的影響，因此，大小完全相同的兩

10、條DNA的遷移率可相差10。非變性聚丙烯酰胺凝膠主要用于制備高純度的DNA片段和檢測蛋白質DNA復合物。,20,用聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測時，通常PCR產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上分離效果優(yōu)于非變性膠。因為雜合個體在PCR后期的循環(huán)中會產(chǎn)生異源雙鏈分子，導致在雜合的情況下膠中產(chǎn)生了3條帶甚至是4條帶，而不是正常的2條帶。這種情況出現(xiàn)會干擾等位基因的統(tǒng)計。,21,染色方法與原理,溴化乙錠（EB）染色法：但是聚丙烯酰胺對熒光燃料溴化乙錠的熒光有猝滅作用，EB染色法很難檢測到少于10ng的DNA條帶。 銀染法（硝酸銀）：是一種檢測微量DNA的理想方法。 優(yōu)點：經(jīng)濟、簡便、快速、靈敏，無污染

11、、分辨率高、結果可永久保存 原理：銀染液中的銀離子(Ag+)可與DNA形成穩(wěn)定的復合物，然后用還原劑如甲醛在堿性條件下使Ag+還原成銀顆粒，可把DNA電泳帶染色成黑褐色,22,載樣緩沖液（loading buffer）,指示劑（溴酚藍或二甲苯氰）一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400等組成載樣緩沖液，加入到擴增好的PCR產(chǎn)物當中。 作用： 1.增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內。 2.形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置。 3.使樣品呈色，使加樣操作更方便。,23,實驗方法與步驟,1.實驗材料 馬貴荔（母本）焦核三月紅（父本）F1雜種群體中部分個體的基因組DNA溶液。每

12、人做4個模板。 一對特異引物： B-F09 F：5TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 3 B-F09 R：5CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG 3,24,2.配制SSR擴增的反應液：,各組份的用量及終濃度如下表，做多個反應時，可將所用的的相同組份一次取樣、混勻后再分裝至各個反應中。,25,3.SSR-PCR,配制好反應液后，放入PCR儀中進行擴增反應，擴增程序為： 94 3min（預變性）； 94 50s55 50s7250s（35個循環(huán)）； 72 10min（延伸反應）,26,4.制備5的變性聚丙烯酰胺凝膠：,將長、短玻璃板固定在制膠板上，用1.0的瓊脂糖封口，將配好的膠溶液沿玻璃板點樣端小心灌入，排除氣泡，待膠灌滿后插入梳子，靜置1h，讓其聚合凝固。,27,5.電泳樣品的準備：在PCR產(chǎn)物中加入8L的loading