1、第三節(jié) 高效液相色譜法的主要類型及其分離原理,一、液液色譜法（或稱液液分配色譜法）,分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異 (一)固定相 載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法） 缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用,常用的幾類載體 ： （1）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體） 由直徑為3040 m的實(shí)心玻璃球和厚度約為12 m 的多孔性外層所組成 （2）全多孔型載體：由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑30 50 m 的多孔型顆粒 （3）全多孔型微粒載體：由nm級的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠。這種載體粒度為5 10 m,固定液 由于液相色譜中，流動相參與選擇作用，流動相極性的微小變化，都會使組分的保留值

2、出現(xiàn)較大的差異。 液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可。如,氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鯊?fù)楣潭ㄒ旱取?(二)流動相 要求流動相對固定相的溶解度盡可能小，因此固定液和流動相的性質(zhì)往往處于兩個極端, 正相色譜固定液極性 流動相極性 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱 適于分離極性組分 反相色譜固定液極性 流動相極性 極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱 適于分離非極性組分,二、化學(xué)鍵合相色譜法,（一）原理 化學(xué)鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)，通過共價鍵將有機(jī)基團(tuán)鍵合在載體（硅膠）表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相 分離機(jī)制：分配 + 吸附（以LLC為

3、基礎(chǔ)） 特點(diǎn)： 不易流失； 熱穩(wěn)定性好 化學(xué)性能好； 載樣量大 適于梯度洗脫,（二）固定相,載體：幾乎都用硅膠。 一般可分三類： （1）疏水基團(tuán) 如不同鏈長的烷烴（C8和C18。）和苯基等 （2）極性基團(tuán) 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。 （3）離子交換基團(tuán) 如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季鍍鹽；作為陽離子交換 基團(tuán)的磺酸等.,鍵合固定相的制備,（l）硅氧碳鍵型（硅酸酯型）（Si-O-C ）鍵合相 最先用于液相色譜的健合固定相,用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)。 由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相,（2）硅氮型

4、（Si-N ）鍵合相 將硅膠表面的羥基先轉(zhuǎn)化成鹵素（氯化），再與各種有機(jī)胺反應(yīng)，可以得到各種不同極性基因的鍵合相?？捎梅菢O性或強(qiáng)極性的溶劑作為流動相 （3）硅碳型（ Si-C）鍵合相 將硅膠表面氯化后，使Si-Cl鍵轉(zhuǎn)化為Si-C鍵。在這類固定相中，有機(jī)基團(tuán)直接鍵合在硅膠表面上。,缺點(diǎn)： 該反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時，必須限制pH在48范圍內(nèi).,（4）硅烷化（SiOSiC）鍵合固定相 將硅膠與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)制備。具有相當(dāng)?shù)哪蜔嵝院突瘜W(xué)穩(wěn)定性，是目前應(yīng)用最為廣泛的鍵合相。 固定相在 pH = 28.5 范圍內(nèi)對水穩(wěn)定，有機(jī)分子與載體間的結(jié)合牢固，固定相不易流失穩(wěn)定性好。 例：十八烷基

5、硅烷鍵合相（簡稱ODS或C18）： 是最常用的非極性鍵合相。它們用于反相色譜法，在70以下和 pH 28范圍內(nèi)可正常工作,（三）流動相,1、正相鍵合相色譜法 流動相極性小于固定相極性。常用非極性溶劑如烷烴類溶劑，樣品組分的保留值可用加入適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑（調(diào)節(jié)劑）的辦法調(diào)節(jié)洗脫強(qiáng)度。常用溶劑有：氯仿、二氯甲烷、乙腈、醇類等。 適用于分離中等極性化合物，如脂溶性維生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有機(jī)氯農(nóng)藥,2、反相鍵合相色譜法 流動相極性大于固定相極性，多以水或無機(jī)鹽緩沖液為主體，再加入一種能與水相混溶的有機(jī)溶劑（ 如甲醇、乙睛、四氫呋喃等）為調(diào)節(jié)。 固定相一般為C18、 C8 應(yīng)用最廣泛,正相色譜

6、和反相色譜,正相色譜和反相色譜的差別：,三、液固色譜法（或稱吸附色譜法）流動相為液體，固定相為固體吸附劑,（一）原理 1、分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異,分離前提：K不等或k不等,2、固定相：與LC比，固定相粒徑不同（10m） （1）硅膠 表面多孔型（薄殼硅膠） 全多孔型 無定形 YWG 56m 5104 球形 YQG 34m 8108 堆積硅珠 YQG 34 m 8108 理想 原理：吸附 特點(diǎn)：峰易拖尾 適用：分離極性化合物,（2）高分子多孔小球：YSG 原理：吸附+分配 兼小孔凝膠作用 特點(diǎn)：柱選擇性好，峰形好，柱效低 適用：分離弱極性化合物,3、流動相：底劑

7、（烷烴）+ 有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - - 4、影響k的因素：與固定相性質(zhì)和流動相性質(zhì)有關(guān) 溶質(zhì)分子極性，洗脫能力，k，tR 溶劑系統(tǒng)極性，洗脫能力，k， tR 注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時間 5、出柱順序： 強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱,6、硅膠吸水量，LSCLLC 硅膠含水量較小 吸附色譜 硅膠極性較大 硅膠含水量17% 分配色譜 硅膠失活載體 吸附的水固定液,四、離子交換色譜法（IEC ）,（一）原理 利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分離 適用無機(jī)離子混合物

8、的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣,陰離子交換：,一般形式： R一AB RBA,陽離子交換：,待測離子與離子交換樹脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng),（二）固定相,種類,陽離子交換樹脂,強(qiáng)酸性,弱酸性,陰離子交換樹脂,強(qiáng)堿性,弱堿性,（三）流動相 通常是鹽類的緩沖溶液 改變 流動相的 pH 緩沖劑（平衡離子）的類型 離子強(qiáng)度 加入有機(jī)溶劑、配位劑等 常用的緩沖劑有：磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、氨水等,五、離子對色譜法,離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)

9、離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。,離子對形成機(jī)理,把和被測物離子A電荷相反的離子B（對離子或反離子）加入到流動相中，使待測離子A與反離子B形成中性離子對AB，該AB離子對的性質(zhì)與A離子或B離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測離子的保留特性。,離子對試劑 用于陰離子分離的對離子： 烷基銨類，如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲基銨等 用于陽離子分離的對離子：烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉 固定相和流動相 性質(zhì)同鍵合相色譜，選擇不同的離子對試劑可以分離酸、堿和離子、非離子的混合物,六、離子色譜法,以離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動相，通常以電導(dǎo)檢測器為通用檢測器。 對離子型化

10、合物的分析，離子色譜法是目前唯一能獲得快速、靈敏、準(zhǔn)確和多組分效果的方法，檢測手段已擴(kuò)展到電導(dǎo)檢測器之外的其它類型的檢測器，如電化學(xué)檢測器，紫外光度檢測器?？煞治龅碾x子從無機(jī)和有機(jī)陰離子到金屬陽離子，從有機(jī)陽離子到糖類、氨基酸等均可用離子色譜法進(jìn)行分析。,七、空間排阻色譜法,（一）分離原理,凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴,小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱,中等體積的分子部分滲透,體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來,固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)凝膠,類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。,（二）固定相凝膠 凝膠是含有大量液體（一般為

11、水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。 軟質(zhì)凝膠 分類 半硬質(zhì)凝膠 硬質(zhì)凝膠,1、軟質(zhì)凝膠 種類：如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu) 特點(diǎn)： 微孔能吸入大量的溶劑，并能溶漲到它干體的許多倍 適用于水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜在高效液相色譜中。,2、半硬質(zhì)凝膠（有機(jī)凝膠） 種類：如苯乙烯二乙烯苯交聯(lián)共聚物凝膠 特點(diǎn)：能耐較高壓力，適用于有機(jī)溶劑作流動相，有一定可壓縮性，可填得緊密，柱效較高。缺點(diǎn)：在有機(jī)溶劑中有輕度膨脹。,3、硬質(zhì)凝膠（無機(jī)凝膠） 是具有一定孔徑范圍的多孔性凝膠，如多孔硅膠、多孔玻璃珠等 凝膠化學(xué)惰性、穩(wěn)定性及

12、機(jī)械強(qiáng)度均好，耐高溫，使用壽命長，但裝柱時易碎，不易裝緊，柱效較低。,（三）流動相,選擇依據(jù)（從樣品的溶解性考慮） 流動相應(yīng)與凝膠本身有相似性 黏度低 與樣品的折光率相差大 能潤濕凝膠，防止吸附作用 常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、N，N-二甲基甲酸胺、三氯甲烷（凝膠滲透色譜）；水（凝膠過濾色譜）等。,第四節(jié) 液相色譜法流動相,一、流動相選擇的一般要求 1、流動相的純度 2、流動相與固定相不互溶，不發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 3、對試樣要有適宜的溶解度 4、必須與檢測器匹配 5、溶劑的粘度要小，可以降低色譜柱的阻力,二、常用溶劑的極性 常用溶劑的極性順序?yàn)椋?水（極性最大）、甲酰胺、乙腈、甲醇、丙醇、丙酮、四

13、氫呋喃、醋酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、環(huán)己烷、己烷、,三、流動相的選擇 根據(jù)流動相所起的作用，可以把溶劑分為底劑和洗脫劑兩種 底劑決定基本的色譜分離情況 洗脫劑則是為了調(diào)節(jié)試樣組分的滯留并對某幾個組分具有選擇性的分離作用,1、鍵合相色譜法 正相色譜： 底劑采用低極性溶劑，如正己烷、苯、氯仿等； 洗脫劑則根據(jù)試樣的性質(zhì)，有針對性地選擇極性較強(qiáng)的溶劑如醚、酯、酮、醇和酸等； 反相色譜中： 以水為流動相的主體，以加入不同配比的有機(jī)溶劑作調(diào)節(jié)劑。常用的有機(jī)溶劑是甲醇、乙腈、二氧六環(huán)、四氫呋喃等,2、離子交換色譜法 離子交換色譜法在含水介質(zhì)中進(jìn)行 組分的保留值可用流動相中鹽的濃度（或離子強(qiáng)度）和pH來

14、控制，增加鹽的濃度導(dǎo)致保留值降低。,3、排阻色譜法 排阻色譜法所用的溶劑必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠并防止吸附作用。 對分離高分子有機(jī)化合物，采用的溶劑主要是四氫呋喃、甲苯、間甲苯酚、N,N-二甲基甲酰胺等 生物物質(zhì)的分離主要用水、緩沖鹽溶液、乙醇及丙酮等,第五節(jié) 色譜分離條件選擇,一、 減小柱內(nèi)展寬，提高柱效 l、固定相 選粒徑小的、分布均勻的球形固定相 首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱,2、流動相 選用低粘度的流動相，有利于增大組分在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)Dm，減少傳質(zhì)阻力 例：甲醇、乙腈等 3、 流速 約1ml/min 4、柱溫的選擇： 選室溫250C左右,二、減少柱外展寬 1、柱前展寬

15、： 主要由進(jìn)樣引起，減小進(jìn)樣器的死體積 2、柱后展寬： 主要由接管、檢測器流通池體積及檢測器響應(yīng)時間等因素所引起,三、分離類型的選擇,1、分析的目的是什么 2、分析對象性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)是什么？ 3、分析樣品的復(fù)雜程度，大概有多少種組分 4、樣品量、樣品的形態(tài) 5、要求的檢測限、測定限、靈敏度、分析時間 6、有無分析實(shí)例和標(biāo)準(zhǔn)樣品以及相關(guān)分析資料 7、實(shí)驗(yàn)設(shè)備情況,液相色譜分離類型選擇參考表,第六節(jié) 高效液相色譜法的應(yīng)用,一、在食品分析中的應(yīng)用 1、食品營養(yǎng)成分分析：蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機(jī)酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋果酸等）、有機(jī)胺、礦物質(zhì)等； 2、食品添加劑分析：甜味劑、防腐

16、劑、著色劑（合成色素如檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)等）、抗氧化劑等； 3、食品污染物分析：霉菌毒素（黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等）、微量元素、多環(huán)芳烴等。,二、在環(huán)境分析中的應(yīng)用 多環(huán)芳烴（特別是稠環(huán)芳烴）、農(nóng)藥（如氨基甲酸脂類，反相色譜）殘留等。 三、在生命科學(xué)中的應(yīng)用 1、低分子量物質(zhì)，如氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)胺、類固醇、卟啉、糖類、維生素等的分離和測定。 2、高分子量物質(zhì)，如多肽、核糖核酸、蛋白質(zhì)和酶（各種胰島素、激素、細(xì)胞色素、干擾素等）的純化、分離和測定。,例1. 環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠(37 50m) 流動相：正己烷 流 速：1.5 m

17、L/min 色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑) 檢測器：差示折光檢測器 可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量 進(jìn)行分析。,例2. 稠環(huán)芳烴的分析,稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：20%甲醇-水 100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 C 柱 壓：70 104 Pa 檢測器：紫外檢測器,四、在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用 1、合成藥物：抗生素、抗憂郁藥物（冬眠靈、氯丙咪嗪、安定、利眠寧、苯巴比妥等）、黃胺類藥等。 2、天然藥物生物堿（吲哚堿、顛茄堿、鴉片堿、強(qiáng)心甙）等 五、在無機(jī)分析中的應(yīng)用 陽離子、陰離子的分析等。,五、制備型液相色譜 （preparative liquid chromatography）,獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。 半制備柱（內(nèi)徑8mm，長度1530cm），一次制備量 .11mg；,1. 色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷） 對分析柱